이 작품은 하워드 휴즈 의학 연구소 (HHMI) 공동 혁신 수상에 의해 지원되었다. 램 시그널링 및 건강 교육 기금의 셀룰러 규정 국립 연구소 (T32 GM008759)와 NIH 루스 L. Kirschstein 사전 박사 연구원 (CA165349-01)에 의해 지원되었다. 우리는 그들의 소중한 의견 교수 마이클 스토 웰 (CU 볼더), 교수 더글러스 말하지 그래과 교수 롭 필립스 (Caltech)에 감사드립니다.

1. 리포좀 준비 <ol><li> 테플론 늘어선 모자와 함께 20 ML의 유리관을 검색합니다. </li><li> 오염을 방지하기 위해 사용하는 사전 클로로포름 모든 유리 제품과 주사기를 청소합니다. </li><li> 250 μL 빵빵한 유리 주사기를 사용하여 유리관에 시약 등급의 클로로포름 100 μL를 전송합니다. </li><li> 100 μL 빵빵한 유리 주사기를 사용하여 동일한 유리관에 시약 등급의 메탄올 30 μL를 추가합니다. </li><li> phosphatidylethanolamine (교황) : 2 MM 7:1.5:1.5 phosphatidylcholine (POPC) 준비하려면 콜레스테롤 지질 솔루션을, 11 밀리그램 / ML 10 밀리그램 / ML 교황과 20 μL의 μL 10 밀리그램 / ML POPC, 42의 216 μL를 전송 20 ML의 유리관에 CHCl 3 콜레스테롤 솔루션. </li><li> lipids의 박막은 유리병의 바닥에서 발견된 때까지 느린 흐름 아르곤 또는 질소 가스를 사용하는 유기 용제를 증발. </li><li> 잔류 용매를 제거하려면 최소 30 분 동안 진공 건조기에서 uncapped 유리관를 놓습니다. </li><li> TR버퍼의 ansfer이 ML은 이전에 하이드 레이트 lipids를로 유리관에, 0.2 미크론 필터를 통과했다. </li><li> ° C에서 하룻밤 4에 혼합 부화하고 48 시간 이내에 사용합니다. </li></ol> 2. 냉동 및 해동 : 30의 리포좀 크기 - 100 nm의 전용 <ol><li> 15 초동안 액체 질소의 리포좀 정지 고정. </li><li> 42에서 가열 블록을 사용하여 리포좀 서스펜션을 녹여 ° ~ 3 분정도 C의 온도. </li><li> 5 사이클 총 단계 2.1 및 2.2를 반복합니다. </li></ol> 3. 밀어냄 정확하게 그들의 가이드북에서 악기 개요를 사용 Liposofast LF-50 압출기를 조립하는 Avestin 지침을 따릅니다. <ol><li> 지원 필터 자료의 대형 홀 지원 화면 (원형 구멍이있는) 장소, 원형 소결 접시 (구멍없이) 한 배수 디스크 (직경 25 ㎜), 하나의 폴리 카보 네이트 막 (직경 25 ㎜)으로 따라갔다. </li><li> 작고 검은 놓으십시오지원 필터 기지로 확보하기 멤브레인 위에 O-링. </li><li> 4 해당 구멍에 4 개의 나사를 조이고으로 가기 필터 압출기을 첨부합니다. </li><li> 대형 압출기 배럴 아래로 필터 압출기 유닛을 조립. 실린더 배럴로 리포좀 솔루션을 추가합니다. 순서 압출 배럴 위에 다음을 추가하십시오 대형 원형 O-링, 좁은 모자, 큰 원형 O-링, 둥근 모자. </li><li> 압출기 배럴 위쪽에 가스 레귤레이터를 부착하여 압력 릴리프 밸브를 포함한 공기 누출을 방지하기 위해 모든 밸브를 닫습니다. 20 ML의 유리관 또는 압출기 필터 유닛 이하 50 ML Erlenmeyer 플라스크를 놓습니다. 안전 밸브 조절기에 연결되어 있고 압력이 600 PSI를 초과하는 경우에 공개할 것입니다. 질소 가스를 켜고 압출기에 연결된 가스 밸브를 엽니다. </li><li> 질소 압력이 400 나노미터 liposomes, 100 나노미터 liposomes을위한 125 PSI, 30 나노미터 liposomes 용 400-500 PSI 25 PSI로 늘립니다. </li><li> 리포좀 susp 조심질소에 의해 강요되는 동안 ension 그것은 용기에 배출로. 더 이상 유리관에 압출기 필터를 통해 액체 전달을 관찰 않을 때까지 질소가 흐르는 유지. </li></ol> 4. 동적 라이트 산란 (DL을) 분석 <ol><li> 20 μm의 리포좀 용액의 50 μL를 준비합니다. </li><li> 전원 및 램프 소스를 켭니다. </li><li> DynaPro 소프트웨어를 엽니다. </li><li> 30 nm의 100 nm의와&gt; 100 나노미터 liposomes을 감지하는 알고리즘 MS800 모델의 liposomes를 검색하는 MS / X 알고리즘 모델에 소프트웨어를 설정합니다. </li><li> 하드웨어에 연결합니다. </li><li> 셀 홀더에 석영 cuvette 및 삽입 리포좀 샘플의 Pipet 14 μL. </li><li> 시작을 누릅니다. </li><li> 30 인수 - ~ 20 이후에 중지를 누르십시오. </li><li> 히스토그램에 기록된 평균 리포좀 직경 봉우리를 분석합니다. </li></ol> 5. Nanoparticle 추적 분석 (NTA) <ol><li> 500 μL, 0.1 μm의의 리포좀을 준비솔루션입니다. </li><li> 물과 에탄올과 샘플 격실을 씻어. </li><li> 보푸라기가없는 종이 타월로 샘플 격실을 건조합니다. </li><li> 레이저 전원과 컴퓨터를 켭니다. </li><li> 샘플 구획​​에 0.1 μm의 리포좀 용액 300 μL를 제공합니다. </li><li> 온도 제어 및 Nanoparticle 추적 분석 소프트웨어를 엽니다. </li><li> 레이저를 설정 버튼을 캡처 누르십시오. </li><li> 무대를 이동하고 현미경의 초점을 조정하기 위해 수평 및 수직 조정을 사용합니다. </li><li> 원하는 온도 (20 ° C)와 녹화 시간 (최소 30 초)로 설정합니다. </li><li> 시간의 지정된 금액에 대한 리포좀 입자의 여러 그림 프레임을 데리고 녹음 버튼을 누릅니다. 그것이 각 입자의 움직임을 추적으로 히스토그램의 직경 리포좀 크기에 해당하는 봉우리를 분석. </li></ol> 6. 대표 결과 압출 방법을 요약 스키마 P입니다그림 1에서 높았다. , 최적의 결과를 얻을 수 30 nm의의 직경과 liposomes의 준비는 ~ 500 PSI 및 100 nm의 직경의 높은 압력을 필요로하는 것은 빠른 필터 속도를 달성하기위한 125 PSI의 압력이 필요합니다. 400 nm의 직경을 보려면 ~ 25 PSI의 낮은 압력 vesicles가 크고 균질 liposomes을 길어지다 및 형성 있도록 느린 필터 율을, 달성하는 것이 좋습니다. 우리는 일관성있는 서브 마이크론 소포 크기를 생산을위한 최적의 압력을 결정하기 위해 일련의 실험을 실시 하였다. 우리는 압력뿐만 아니라 압출은 기공 크기 30, 100, 400 nm의 폴리 카보 네이트와 필터를 통과의 수를 다양하고 각각의 원하는 크기에 적절한 압력을 발견했다. 30 나노미터 모공의 경우, 500 PSI 아래의 압력은 신장 때문에 큰 소포 크기를 초래, 유속이 줄어 듭니다. 100 나노미터 모공의 경우 지속적인 흐름이 125 PSI에 달성되었다. 400 나노미터 모공의 경우, 낮은 압력 (25 PSI)는 vesicles가 큰 소포의로 길어지다하실 수 있습니다izes. 느린 드롭 현명한 여과 유량이 큰 서브 마이크론 vesicles 13 만들 최적입니다. 우리는 세 가지 직경의 크기, 즉 30, 100 400 nm의를 통해 압출 리포좀 크기를 결정하기 위해 DL을 수행했습니다. DL을이 입자 직경을 결정하기 위해 흩어져 빛을 수집 설립 방법입니다. 필터 구멍을 통해 오 패스 2 25 PSI에서 400 nm의 폴리 카보 네이트 막과 125 PSI에서 100 nm의 폴리 카보 네이트 멤브레인, 필터 기공을 통해 오 패스 500 PSI에 폴리 카보 네이트 30 nm의 막 통해 2 mm의 우리는 압출 충분 liposomes 필터 구멍을 통해 전달합니다. 30, 100 400 nm의 기공 크기 liposomes와 DL을 기준으로 측정의 직경 66 줄 ± 28, 138 ± 18 360 ± 25 nm의 (그림 2). 그것이 47 ± 16 nm의 직경을 기록한 그림 2와 같이 50 나노미터 폴리스티렌 구슬의 정지 보정 표준으로 사용되었다. 퍼센트 polydispersity은 리포좀 크기 사이에는 중복이 없다는 것을 보여줍니다. 그것은이 악기가 큰 입자를 12으로 가지고 알려진 편견으로 인해 DL을 분석을 사용할 때 30 nm의 이상의 직경을 관찰하는 것이 일반적입니다. 크고 작은 입자의 빛 산란 강도는 서스펜션 12 liposomes를 해결하는 하나의 검출 방법에서 동시에 수집하기 때문에 어렵습니다. 이 기악 제한에도 불구하고, 교정 곡선은 가까운 선형 상관 관계에 대해 설명합니다. NTA는 입자 굴절률이나 밀도 독립 액체 매질에서 확산의 직접적인 관찰에서 각 입자의 크기를 측정하는 새로운 기술입니다. 이것은 고해상도 기술은 DL을 가진 liposomes의 측정을 보완하는 데 사용할 수 있습니다. NTA는 교정에 사용되었다 직경 95 ± 48 356 ± 51 nm의 두 100 nm의 400 나노미터 폴리스티렌 솔루션을 기록했다. 30 nm의 100 nm의의 지질 솔루션은 더 검색을 가지고 관찰되었다<html> 등 29 평균 크기는 ± 14, 95 ± 17, 359 ± 73 nm의 생산을, 그림 3에 표시된 DL을 비교한 경작할 직경. 1000 NM - NTA는 감도가 50의 입자를 측정할 수 있기 때문에 미세한 입자를 계량하기위한보다 일반적인 특성화 기법이 될 수 있습니다. 교정 곡선은 녹화된 NTA 직경 대 폴리 카보 네이트 멤브레인 모공 사이에 선형 상관 관계를 보여줍니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 리포좀의 크기 </td><td> 감지 임계값 </td><td> 예상 최소 입자 크기 (NM) </td></tr><tr><td> 30 nm의 </td><td> 11 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 100 nm의 </td><td> 11 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 nm의 </td><td> 21 </td><td> 400 </td></tr></tbody></table> 표 1. Nanosight 매개 변수. ad/4151/4151fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1. 설명 압출 방식의 플로우 차트, 어떻게 압력과 질소 유량은 다른 리포좀 지름의 균질성을 제어합니다. 리포좀 수화에 따라 다양한 크기의 unilamellar vesicles 다른 압력에서 다른 폴리 카보 네이트 멤브레인 필터 모공을 통해 압출 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig2.jpg" /> 그림 2. 압출에 따라 양적 리포좀 크기를 설명하는 동적 라이트 산란 (DL을) 데이터. () 막대 그래프는 세 리포좀 샘플의 직경을 설명하기 위해 표시됩니다. 50 나노미터 폴리스티렌 (PS) 구슬의 보정 기준은 참고 자료로 사용되었다. 평균 리포좀 지름은 각 샘플에 대한 막대 위에 표시됩니다. x 축은 솔루션을 통해 압출 있었다 그중 기공 크기를 설명합니다. y 축은 DL을 녹음한 직경에 대해 설명합니다. 비록 30 nm의 100 nm의 크기 레코드더 큰 400 nm의 크기가 약간 낮은 크기를 기록하면서 에드는 자신의 기공 크기보다 높은 가치, 교정 곡선 (B)는 X-축은 폴리 카보 네이트 멤브레인 기공 크기를 표현 근처 선형 상관 관계를 보여주고, y 축은 설명 DL을하여 리포좀 직경을 기록했다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig3.jpg" /> 압출 다음 리포좀 크기를 설명하는 그림 3. Nanoparticle 추적 분석 (NTA) 데이터. () 막대 그래프는 각 리포좀 시료의 직경을 나타냅니다. x 축은 솔루션을 통해 압출 있었다 그중 기공 크기를 설명합니다. y 축은 NTA에 의해 기록된 크기의 직경을 설명합니다. 평균 리포좀 지름은 각 샘플 위에 분류됩니다. (B) NTA 교정 곡선은 기록 직경 대 필터 멤브레인 기공 크기 사이에 DL을 교정 곡선보다 더 선형 상관 관계를 보여줍니다. x 축은 폴리 카보 네이트 멤브레인 기공 크기를 설명. y 축은 NTA에 의해 기록된 리포좀 직경에 대해 설명합니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig4.jpg" /> 그림 4. 압출 다음 각 리포좀의 크기 (500 μm의)를 보여주는 부정적 얼룩 전송 전자 현미경 (TEM) 이미지. 물에 1 % Uranyl 아세트산 전에 34,000 × 확대 건조 및 이미징에 샘플을 착색하는 데 사용된 곳을 탄소 Formvar 메쉬 격자는 부정, 샘플 염색법 이전에 퇴원했다. 크기 30, 100, 400 nm의은 분명히 서로 별개입니다. 배율은 25,000 ×로 설정되었다. 눈금 막대는 0.5 μm의를 나타냅니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig5.jpg" /> 그림 5. 시간 코스 실험은 세 리포좀 크기와 함께 실시되었다. 동적 광 산란 (DL을)이 각각 리포좀 용액 후 즉시 압출을위한 측정되었다. 모든 리포좀 솔루션은 4에 저장된 °C 하룻밤. 그들의 지름은 하룻밤 배양 후 DL을하여 기록되었다. 아니 변화에 리틀은 16 시간 잠복기 후에 관찰되었다.

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	<li>Connor, J., Bucana, C., Fidler, I. J., Schroit, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation-dependent+expression+of+phosphatidylserine+in+mammalian+plasma+membranes:+quantitative+assessment+of+outer-leaflet+lipid+by+prothrombinase+complex+formation.">Differentiation-dependent expression of phosphatidylserine in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer-leaflet lipid by prothrombinase complex formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3184-3188 (1989).</li><li>Smith, S. A., Morrissey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+incorporation+of+tissue+factor+into+liposomes.">Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1155-1162 (2004).</li><li>Hui, E., Johnson, C. 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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

Avestin Liposofast LF-50 압출기를 사용하여, 우리는 얼마나 작은 크기, 합성 liposomes는 압력 제어 시스템을 통해 준비가되어 보여주었다. 그것은 multilamellar vesicles 작은 nanoparticles의 생산으로 이어질 수 리포좀 보습, 따라 자발적으로 형성 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이러한 작은 multilamellar vesicles은 필연적으로 대형 필터 기공 제작한 unilamellar vesicles의 솔루션에 이질의 원인, 대형 폴리 카보 네이트...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 클로로포름 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 02432-25ML </td><td> 95 %의 안정제 </td></tr><tr><td> 고급 메탄올 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 179337-4L </td><td></td></tr><tr><td> Liposofast LF-50 압출기 </td><td> Avestin 주식 회사 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Phospholipids </td><td> 아벤티 폴라 Lipids </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 폴리 카보 네이트 나란하고 세공 </td><td> Avestin 주식 회사 </td><td></td><td> 25mm 직경 </td></tr><tr><td> 디스크에게 PE 드레인 </td><td> Avestin 주식 회사 </td><td> 230,600 </td><td> 25mm 직경 </td></tr></tbody></table>

constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of nano-sized lipid vesicles

Liposomes는 광범위하게 단백질 - 단백질과 단백질 - 지질 상호 작용 3, 모니터 약물 전달 4,5, 그리고 캡슐 4 공부하는 플랫폼을 흉내낸 세포막로 사용되는 천연 및 합성 phospholipids로 이루어진 인위적으로 준비 vesicles 있습니다. Phospholipids 자연스럽게 마이셀에서 자신을 구별, 곡선 지질 bilayers을 작성 6. Liposomes은 전통적으로 bilayers, 즉 대형 unilamellar vesicles (LUVs), 작은 unilamellar vesicles (포드 SUV 차량용) 및 multilamellar vesicles (MLVs) 7의 크기와 수에 의해 분류됩니다. 특히, 다양한 크기의 균질 liposomes의 준비는 엔도와 exocytosis, 멤브레인 융합, 그리고 단백질 밀매 8, 세포 신호 전달에 중요한 역할을 막 곡률을 공부하는 것이 중요합니다. 400 - 여러 그룹은 단백질이 막 곡률을 포함하기 때문에 직경의 liposomes 준비 과정 &lt;100 조절하는 데 사용되는 방법 분석세포의 기능 3 자신의 행위를 파악하고 NM. 기타 차량에 관심 9 마약을 운반하고 전달로 liposomes을 공부하고, 리포좀은 마약 캡슐에 초점. 리포좀 형성 9시 보고된으로 약물 캡슐이 형성될 수 있습니다. 우리 압출 단계는 두 가지 이유로 캡슐화된 약물에 영향을 미치지 않습니다, 즉 (1) 약물 캡슐이 단계 이전에 달성되어야하고 (2) liposomes 안전 수성 코어에서 마약을 운반, 그들의 자연적인 biophysical 안정성을 유지한다. 이러한 연구 목표는 더욱 안정적인 서브 마이크론 지질 vesicles을 설계하기위한 최적의 방법에 대한 필요성을 제안합니다. 그럼에도 불구하고, 현재 리포좀 준비 기술 (sonication 10, 냉동 및 해동 10, 침전)이 biophysical를 제한 높은 일관성 및 효율성 10,5와 높은 곡면 (예 : 직경 &lt;100 nm의)에 liposomes의 준비를 허용하지 않습니다 emergi의 연구막 곡률 감지의 NG 분야. 여기, 우리는 생물 학적 관련 liposomes 다양한위한 강력한 준비 방법을 제시한다. 가스 기밀 주사기와 폴리 카보 네이트 점막 10,5를 사용하여 수동 압출은 일반적인 관행이지만 구멍 크기가 적용된 매뉴얼의 압력 변화로 인해로 인해 &lt;100 nm의 사용시 이질이 자주 관찰된다. 우리는 직경 30 nm의 400 사이의 범위 합성 liposomes를 준비하는 일정한 압력 제어 압출 장치를 채용. 동적 광 산란 (DL을) 10, 전자 현미경 11 nanoparticle 추적 분석 (NTA) 12 우리의 프로토콜에 설명된대로 상용 폴리스티렌 (PS) 교정 표준으로 사용되는 구슬과 함께 리포좀 크기를 계량하는 데 사용되었다. 근처의 선형 상관 관계는 우리의 압력 제어 리포좀 준비 높은 충실도를 나타내는업자 기공 크기와 실험적으로 결정 liposomes 사이에 관찰 충족되었다석탄통. 더 나아가, 우리는이 지질 소포 준비 방법은 여러 가지 리포좀 크기의 독립, 일반적으로 적용하는 것으로 나타났습니다. 마지막으로, 우리는 또한 최대 16 시간 동안이 준비된 liposomes 안정 것을 시간 코스 연구에서 증명하고있다. 대표적인 나노 크기의 리포좀 준비 프로토콜은 다음과 시연한다.

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Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

이 프로토콜은 균질성의 높은 수준과 함께 서브 마이크론 크기의 지질 vesicles을 준비하기위한 압출 방식을 설명합니다. 이 방법은 리포좀 준비 제어 질소 유량과 압력 제어 시스템을 사용합니다. 지질 준비<sup&gt; 1,2</sup&gt;, 리포좀 압출 및 크기 특성화는 제한된 표시됩니다.

나노 크기의 지질 Vesicles의 준비를 위해 지속적인 압력 제어 압출 방법

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

constant-pressure-controlled-extrusion-method-for-preparation-nano

Research

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Bioengineering

23.8K 조회수.  University of Colorado Boulder. 이 프로토콜은 균질성의 높은 수준과 함께 서브 마이크론 크기의 지질 vesicles을 준비하기위한 압출 방식을 설명합니다. 이 방법은 리포좀 준비 제어 질소 유량과 압력 제어 시스템을 사용합니다. 지질 준비 1,2, 리포좀 압출 및 크기 특성화는 제한된 표시됩니다.

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Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

방법 혈액 - 뇌 장벽의 인간 세포 기반의 연락 모델의 준비를 위해 개선

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

연구

생체공학

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

피부에서 타입 I 콜라겐의 제조를위한 개선 된 방법

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

미세 유체 제트를 사용하여 지질 이중층 소포 세대

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

운모의 준비 고해상도 광학 현미경 이미징 지질 이중층 지원

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 방법에 의해 생체막 제작

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

고체 지질 나노 입자 (SLNs) 세포 내 타겟팅을위한 응용 프로그램

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a high-protein crambe meal that has limited value, as it is not fit for food or feed use. However, it contains proteins that could potentially make it a suitable raw material for higher-value products. The purpose of this study was to find methods of making this side stream into extruded films, showing that products with a higher value can be produced. The study mainly considered the development of material compositions and methods of preparing and extruding the material. Wheat gluten was added as a supportive protein matrix material, together with glycerol as a plasticizer and urea as a denaturant. The extrudate was evaluated with respect to mechanical (tensile testing) and oxygen barrier properties, and the extrudate structure was revealed visually and by scanning electron microscopy. A denser, more homogeneous material had a lower oxygen transmission rate, higher strength, and higher extensibility. The most homogeneous films were made at an extruder die temperature of 125-130 &#176;C. It is shown here that a film can be extruded with promising mechanical and oxygen barrier properties, the latter especially after a final compression molding step.

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

The side stream from plant oil production of Crambe abyssinica has limited value. The purpose of this study was to find methods for extruding materials based on this side stream, demonstrating that products with a higher value can be produced. The extrudates were found to have promising properties.

의 필름 압출<em&gt; Crambe의 abyssinica</em&gt; / 밀 글루텐 블렌드

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical development, not only their pharmaceutical activity is important but also their production needs to be evaluated. In this context, research focuses on the isolation of EVs, their characterization, and their storage. The present manuscript aims at providing a facile procedure for the assessment of the effect of different storage conditions on EVs, without genetic manipulation or specific functional assays. This makes it possible to quickly get a first impression of the stability of EVs under a given storage condition, and EVs derived from different cell sources can be compared easily. The stability measurement is based on the physicochemical parameters of the EVs (size, particle concentration, and morphology) and the preservation of the activity of their cargo. The latter is assessed by the saponin-mediated encapsulation of the enzyme beta-glucuronidase into the EVs. Glucuronidase acts as a surrogate and allows for an easy quantification via the cleavage of a fluorescent reporter molecule. The present protocol could be a tool for researchers in the search for storage conditions that optimally retain EV properties to advance EV research toward clinical application.

Here we present a readily applicable protocol to assess the storage stability of extracellular vesicles, a group of naturally occurring nanoparticles produced by cells. The vesicles are loaded with glucuronidase as a model enzyme and stored under different conditions. After storage, their physicochemical parameters and the activity of the encapsulated enzyme are evaluated.

세포 밖 소포체의 저장 안정성 평가

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

암 세포 배양에서 수집된 매체에서 액체 크로마토그래피 질량 분광법에 의해 분석된 선택된 Kynurenines의 동시 정량화

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure single-molecular binding kinetics, assess mechanical properties of ligand-receptor interactions, visualize protein dynamic conformational changes and more excitingly elucidate receptor mediated cell mechanosensing mechanisms. More recently, BFP has been used to measure the spring constant of molecular bonds. This protocol describes the step-by-step procedure to perform molecular spring constant DFS analysis. Specifically, two BFP operation modes are discussed, namely the Bead-Cell and Bead-Bead modes. This protocol focuses on deriving spring constants of the molecular bond and cell from DFS raw data.

A biomembrane force probe (BFP) is an in situ dynamic force spectroscopy (DFS) technique. BFP can be used to measure the spring constant of molecular interactions on living cells. This protocol presents spring constant analysis for molecular bonds detected by BFP.

생체멤브레인 포스 프로브 분광법에 의한 분자 스프링 상수 분석

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...