인플루엔자 항원 마이크로어레이는 단지 하나의 마이크로리터의 작은 혈액 샘플 부피에서 인플루엔자의 300 개 이상의 변종에 대한 다중 항체 동위 형의 동시 측정을 허용합니다. 마이크로어레이는 인플루엔자 균주의 항원 지형을 가로지르는 인플루엔자 항체의 폭을 높은 처리량 측정을 용이하게 한다. 이전에 가능했던 것보다 더 자세하게 인플루엔자 항체를 특성화함으로써, 이 마이크로어레이는 특정 사람들이 인플루엔자 감염을 개발하는 이유를 결정하는 데 도움이 될 수 있으며 다른 사람들은 그렇지 않습니다.
항원 마이크로어레이 기술은 실험실에서 35개의 상이한 병원체에 적용되어 60, 000항원 표적및 전 세계적으로 전염병 사례와 건강한 대조군으로부터 수집된 50, 000개의 혈청 표본에 대한 항체의 측정을 허용합니다. 대면 워크숍을 통해 이 기술을 가르쳤기 때문에, 우리는 이 기술을 시각적으로 보여줄 수 있다는 것이 이해와 성과에 매우 중요하다는 것을 발견했습니다. 절차를 시연하는 것은 알 자신스카스와 라파엘 드 아시스, 우리의 실험실에서 프로젝트 과학자가 될 것입니다.
마이크로어레이 프린터를 사용하여 항원을 인쇄하려면 384웰 소스 플레이트에서 항원을 샘플 채널에 흡인할 수 있는 저용량 마이크로어레이 스포팅 핀이 있는 프린터를 선택하고 직접 접촉 및 모세관 작용을 통해 항원을 16패드 니트로셀룰로오스 코팅 유리 슬라이드에 증착한다. 인쇄 소프트웨어에서 플레이트 텍스트 상자에 사용되는 샘플 플레이트 수를 입력하고 분석에 사용할 플레이트 유형을 선택합니다. 핀 구성을 선택하고 슬라이드 원점에서 원점을 오프셋으로 설정하고 인쇄 핀이 슬라이드에서 인쇄를 시작하는 위치로 설정합니다.
어레이 디자인 탭에서 배열의 크기와 모양을 정의하고 인쇄 핀이 샘플을 픽업하고 분배하는 방법에 대한 매개 변수를 선택합니다. 핀 청소 및 블로팅 프로토콜을 구성하고 샘플 블록이 슬라이드에 인쇄되는 시퀀스를 정의합니다. 어레이 소프트웨어는 각 마이크로어레이 내에서 항원 배열을 설명하기 위해 인추가 된 그리드 인덱스 파일을 생성합니다.
원하는 프로토콜로 인쇄 소프트웨어를 프로그래밍한 후 인쇄 실행을 시작합니다. 완료되면 실온의 건조기 캐비닛에 방광 상자에 프로브되지 않은 마이크로어레이 슬라이드를 놓습니다. 마이크로어레이의 항체에 대한 세라를 프로브하려면 클립을 사용하여 마이크로어레이 슬라이드 패드쪽을 프로빙 챔버에 부착하고 챔버를 프레임에 배치합니다.
슬라이드를 조립할 때 쉽게 파손되어 재수화 후 누출을 확인하십시오. 필요한 경우 슬라이드를 분해하고 다시 어셈블하여 누출을 수정합니다. 슬라이드를 100마이크로리터의 여과된 블로킹 버퍼로 재수화하고 샘플당 100마이크로리터에서 1 내지 100비율로 세라를 희석시다.
그런 다음, 상온에서 30분 동안 재수화된 마이크로어레이 슬라이드와 희석된 세라를 배양하고 궤도 셰이커에서 분당 100~250회 회전을 배양한다. 인큐베이션의 끝에서, 이차 컬렉션 플라스크와 진공 라인에 연결된 파이펫 팁을 사용하여 패드를 건드리지 않고 각 챔버의 모서리에서 차단 버퍼를 조심스럽게 흡인하고 패드가 건조할 수 없이 즉시 패드에 희석된 세라를 추가합니다. 그런 다음, 습도를 유지하기 위해 밀봉 된 습한 종이 타월이 들어있는 트레이에 덮인 프레임을 놓고 흔들 셰이커에 섭씨 4도에서 밤새 프레임을 배양합니다.
퀀텀닷의 경우, 시레를 바르고 100마이크로리터당 100마이크로리터의 신선한 TTBS 버퍼로 슬라이드를 헹구고 궤도 셰이커에서 각각 5분 동안 헹구십시오. 슬라이드는 양자점의 혼합물로 배양된 다음 프로토콜에 설명된 대로 세 번 세척하여 방금 입증된 것과 동일한 기술을 사용한다. 마지막 세척 후 챔버에서 슬라이드를 조심스럽게 제거하고 여과 된 이중 증류수로 슬라이드를 부드럽게 헹구고 각 슬라이드를 50 밀리리터 튜브에 놓습니다.
그런 다음 슬라이드를 원심 분리로 말리십시오. 마이크로어레이 슬라이드의 이미지를 수집하려면 먼저 휴대용 이미저를 켜고 슬라이드를 조심스럽게 배치하여 이미징 챔버의 슬라이드 홀더에 아래로 이미지를 촬영합니다. 이미징 소프트웨어를 열고 구성된 이미저 탭 아래에서 적절한 슬라이드 구성을 선택합니다.
이미지 제어 탭에서 적절한 형광 채널을 선택하고 세라의 반응성에 따라 노출 및 획득 시간을 조정합니다. 그런 다음 캡처를 클릭하여 이미지 수집을 시작합니다. 수집이 끝나면 선량마커에 지향되는 그리드를 사용하여 배열 스팟을 감지합니다.
스팟 강도를 측정하려면 파일 정보 패널에서 gal 파일을 업로드하고 분석 출력 파일이 분석 옵션 섹션에 저장될 폴더를 지정합니다. 이미지 제어 탭에서 획득한 이미지 중 하나를 열어 정량화하고 자동을 선택합니다. 배열 분석 섹션에서 소프트웨어의 지시에 따라 fiducial 템플릿을 만듭니다.
일괄 처리를 클릭하여 정량화할 이미지가 포함된 폴더를 선택하고 방금 만든 fiducial 템플릿을 선택합니다. 이 소프트웨어는 각 이미지를 분석하고 스팟 강도를 정량화합니다. 그런 다음 원시 데이터를 분석하여 항원 및 혈청 표본을 통해 항체 결합을 비교합니다.
본 대표적인 연구에서는, 사용된 이차 항체는 각각 IgG와 IgA 항체의 멀티플렉스 검출을 위해 585 나노미터에서 방출되는 양자도에 공해진 800 나노미터및 염소 항인간 IgA에서 방출되는 양자도에 공주된 염소 항인간 IgG가 각각 있었다. 결과 열 맵에서, 높은 표현을 가진 임상적으로 관련된 아류형만 더 높은 수의 나머지 모든 하위 유형을 나타내는 플러스 기호로 공간을 절약하기 위해 레이블을 지정했습니다. 혈청 IgA와 IgG는 헤마글루티닌과 뉴라미니다아제 분자 형태 및 아류형에 의해 그룹화되었다.
헤마글루티닌 헤드 그룹의 높은 특이성을 입증하기 위해 전체 헤마글루티닌 및 삼중화 전체 헤마글루티닌 항체의 임상 아류형 및 고중 반응성에 대한 항체가 재고 영역을 포함시켰다. 마이크로어레이상에서 측정된 인플루엔자 항체 반응은 헤마글루티온 억제 및 미세 중화 측정을 포함한 전통적인 기술에 의해 확인될 수 있다. 이 기술은 인플루엔자 헤드 그룹에 대한 항체의 아류형 특이성 및 인플루엔자 감수성에 대한 IgA 및 IgG 항체의 상대적 중요성에 대한 통찰력을 생성했습니다.
재료중 어느 것도 매우 위험하지 않지만 모든 인간 혈청 샘플은 기관 생물 안전 프로토콜에 따라 처리되어야합니다.
