우리는 산호 건강을 증진시키고 동시에 오염으로 인한 영향을 완화할 수 있는 프로바이오틱스를 분리하고 조립할 수 있으며, 이는 변화하는 세상에서 암초의 지속성에 기여할 수 있습니다. 설명된 격리 및 선별 접근법은 산호와 같은 해양 생물에 오염물질 또는 기타 유익한 특성의 저하와 같은 주요 대사 활동을 제시하는 미생물을 선택하는 데 사용될 수 있다. 이 방법은 오염 물질을 분해할 수 있는 미생물을 분리하기 위해 적용될 수 있다.
그리고 또한, 다른 재료원은 식물, 토양, 물, 아무것도 와 같은 다른 환경 샘플에서 사용될 수 있습니다. 문학을 공부하고 당신의 목적을 위해 좋은 후보가 될 수있는 긴장에 초점을 하려고합니다. 가능하면, 그 균주에 대한 격리 방법을 지시하고 알려진 병원체를 피하십시오.
그리고 박테리아의 컨소시엄을 사용하는 것을 목표로하는 경우, 컨소시엄의 구성원이 서로에 대한 적대감 활동이 있는지 먼저 조사하는 것이 매우 중요합니다. 산호는 멸종의 위험이 증가하고 있기 때문에,이 방법론은 전 세계적으로 시작되고 확산하고 방법을 표준화 할 필요가있다. 일부 산호 연구원은 기존의 미생물학경험이 없기 때문에 이러한 접근 방식을 진행하는 방법에 대한 조언을 자주 요청해 왔습니다.
먼저, 각 대상 샘플링 사이트에서 나사 캡이 있는 멸균 병을 사용하여 트리플리케이트로 500밀리리터의 물을 수집합니다. 나중에 샘플 처리가 진행되는 경우 병을 섭씨 4도로 유지하십시오. 멸균 펜치와 집게 쌍을 사용하여 물 샘플의 동일한 샘플링 사이트에서 산호 조각을 절단하십시오.
살균 3% 식염수 또는 인공 해수의 20 밀리리터를 사용하여 시료 산호 조각을 헹구어 바닷물의 느슨하게 부착된 자유 생물 박테리아를 제거합니다. 집게를 사용하여 각 산호 조각을 멸균 식염수 용액이 들어 있는 스크류 캡을 사용하여 멸균 용기에 넣습니다. 멸균 집게와 펜치를 사용하여, 계량 스케일에 멸균 페트리 접시에 산호 조각의 5 그램의 무게.
산호 시료 5그램을 멸균 박격포로 옮기고 멸균 유봉을 사용하여 메이세레이트합니다. 멸균 주걱을 사용하여, 3%의 염화 나트륨 멸균 용액의 25 밀리리터를 포함하는 멸균 배양 플라스크로 메이션 샘플을 전송하고 10 에서 15 유리 구슬2.5 밀리미터. 20 밀리리터 멸균 식염수 용액을 사용하여 박격포를 튜브안으로 씻어 메이라이트의 최대 양을 회수하십시오.
다른 산호 구획에서 미생물을 분리하려면 샘플링 사이트의 수온에서 16 시간 동안 150 배g의 일정한 교반 하에 플라스크를 유지하십시오. 박테리아를 선택하려면 먼저 산호 시료를 위한 멸균 식염수 용액에서 최대 10~음수 9까지 직렬 희석을 수행하고 물 샘플의 경우 최대 10~10개의 음수 6개를 수행한다. 파이펫 희석은 팁을 버리기 전에 다섯 번 위아래로 희석됩니다.
그런 다음 각 소용돌이. 다음 직렬 희석을 수행하기 전에 매번 샘플을 5초 동안 소용돌이칩니다. 3% 나트륨 염화리소제니 국물 한미지를 함유한 페트리 접시에 각 희석제 100마이크로리터가 접시에 담아 접시에 담아 놓습니다.
예를 들어 섭씨 26도에서 1~3일 동안 플레이트를 배양합니다. 하루에 한 번 접시를 확인합니다. 줄무늬 플레이트 기술을 사용하여 새로운 플레이트에 뚜렷한 성장 형태를 제시하는 식민지를 선택하고 격리합니다.
접시에 순수한 식민지가 자라기 위해 필요에 따라이 단계를 여러 번 반복하십시오. 원고에 설명된 대로 섭씨 4도 또는 글리세롤에 분리된 분리를 저장합니다. EE2 분해 능력 테스트를 수행하려면 신선한 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 튜브에서 멸균 LB 배지 의 2 밀리리터에 접종하십시오.
글리세롤 재고인 경우 글리세롤 세균 육수 10마이크로리터를 LB 천판에 적시십시오. 하룻밤 사이에 섭씨 24~28도의 인큐베이션을 통해 단일 식민지가 자라도록 합니다. LB 배지가 함유된 튜브를 일정한 동요 하에 150배g에서 하룻밤 사이에 섭씨 24~28도에 놓습니다.
세균성 성장 후, 실온에서 8 분 동안 8, 000 배 g에서 세포를 원심분리하여 세포를 펠릿. 상부체를 폐기합니다. 나머지 LB 국물을 세척하려면 식염수 2 밀리리터를 추가하여 세포를 다시 중단합니다.
탄소 공급원의 흔적이 없음을 보장하기 위해 세탁을 두 번 반복하십시오. 유일한 탄소 공급원으로 EE2를 함유하는 최소 부시넬 하스 배양 배지에서 세척 및 재중단 된 세포를 접종한다. 600 나노미터에서 광학 밀도와 16~72시간의 인큐베이션 후 LB 천 배지의 식민지 형성 단위로 세균 성장을 평가합니다.
유한 용해 분획과 유한 탄소 공급원으로 오일-물 불용성 분획이 포함된 최소 미디어를 제조하려면 바닥에 밸브가 들어있는 필터 플라스크에 멸균 증류수 500밀리리터에 1-2%의 원유를 첨가합니다. 플라스크를 섭씨 24~28도에서 48시간 동안 150배g으로 일정한 동요 상태로 유지하십시오. 그 후, 플라스크를 안정된 표면에 놓고 10~20분 정도 기다려야 용해성 및 불용성 분획이 분리되도록 합니다.
그런 다음 바닥 필터 플라스크를 열어 오일-물 용해 분획을 새로운 멸균 플라스크로 전송하여 오일-워터 불용성 분획을 절약합니다. 그런 다음 부시넬 하스 아가르 최소 배지 2병을 준비한다. 자동 복제합니다.
오일-물 수용성 분획과 결합하여 500 밀리리터의 천지를 만드는 유일한 탄소 공급원으로 결합하십시오. 오일 워터 불용성 분획과 동일한 작업을 수행하고 개별 페트리 접시에 각 매체의 약 25 밀리리터를 전송합니다. 오일 분해 박테리아를 분리하려면 이전에 희석된 샘플과 각 희석제의 파이펫 100 마이크로리터를 한천 매체를 함유한 페트리 접시에 재사용하여 접시를 접시에 넣습니다.
플레이트에 대한 음의 컨트롤을 유지하는 것을 기억하십시오. 대상 온도에서 1~3일 동안 요리를 배양하고 이전과 같이 격리 절차를 반복합니다. 이 프로토콜에서 미생물은 다양한 수원과 산호 누빈으로부터 분리되어 푸티블 BMC 특성을 제시하고 다양한 종류의 오염 물질을 저하시킬 수 있었습니다.
리우데자네이루 연방대학의 환경위생 실험센터에서 수거된 하수처리장에서 수거된 물 샘플을 사용하여 EE2를 저하시킬 수 있는 33개의 세균균이 고립되었다. 또한, 오일 분해 박테리아를 선택하는 기술을 사용하여, 오일 물 수용성 분획과 오일물 불용성 분획을 모두 저하시킬 수 있는 20개의 균주가 분리되었다. 미생물에서 BMC 특성을 선별하였고, 그 중에서도 산호 병원체 비브리오 콜레라리 리티쿠스에 대한 강력한 적대적 활성을 제시하는 균주, 우레아를 저하시킬 수 있는 균주, 좋은 카탈라제 생산자 및 잠재적으로 유익한 유전자를 제시하는 미생물이 발견되었다.
생물 정화 및 BMC 접종을 모두 사용하여 오일 노출 영향에서 산호를 예측할 수 있었습니다. 산호로부터 분리된 오일 바이오레메디터 PBMC 컨소시엄은 1%의 오일에 노출된 산호 누빈에 접종되었습니다. 그것은 예방 접종없이 산호 건강에 비해 더 나은 보존 광화학 능력을 보였다.
샘플을 실온에 너무 오래 두지 마십시오. 그렇지 않으면, 미생물 지역 사회는 변경될 수 있고 질병 관련 미생물은 그 외를 과도하게 성장할 수 있습니다. 원유는 독성이 있습니다.
사용하기로 결정한 이 또는 기타 오염 물질과 함께 작업할 때 적절한 개인 보호 장비를 사용해야 합니다. 산호 복원 및 해양 생물 교정 분야에서 혁신적인 방법을 포장한 이 기술은 잠재적으로 글로벌 변화로 인한 경제적, 생태적 및 사회적 영향을 최소화하는 데 사용될 수 있습니다.
