이 기술은 drosophila 멜라노가스터에서 학습 및 메모리 형성의 기본 학습 및 메모리 형성을 위한 생리적 매개 변수로서 시냅스 칼슘 활성의 실시간으로 관찰을 용이하게 한다. 연관 훈련 전후의 냄새에 대한 신경 반응을 비교함으로써 시냅스 활동과 개별 과일 파리의 메모리 추적 형성 사이의 직접적인 상관 관계를 그릴 수 있습니다. 관심의 특정 뉴런이 원하는 GAL4 와 UAS 구조를 운반하는 여성 처녀와 남성 파리를 교차 하는 유전으로 인코딩 된 칼슘 표시기를 표현하는 형질 전환 과일을 생산하기 위해 3 ~ 6 일 후에 여성 자손나이.
이미징을 위한 비행을 준비하려면 미세 한 집게를 사용하여 얼음 마취 비행을 사용자 정의 준비 된 이미징 챔버에 배치하십시오. 해부 현미경을 사용하여 흉부와 다리를 챔버 의 하단에있는 전선과 접촉하고 머리가 평평하게 누워 있습니다. 투명한 접착 테이프로 비행을 고정하고 외과 용 메스 블레이드를 사용하여 머리 주위의 테이프의 창을 잘라 안테나가 덮여 있고 흉부의 앞쪽 부분만 노출됩니다.
오목한 볼록한 턱이 들고 있는 곤충 핀을 사용하여 파란색 광 경화 접착제로 머리의 측면과 뒷면을 조심스럽게 둘러싸습니다. 그리고 접착제를 설정하는 LED 램프를 방출 하는 파란색 빛을 사용 하 여. 접착제가 완전히 설정되면 플라이 헤드의 등대 표면에서 잔류되지 않은 접착제를 지우고 링거 용액을 한 방울로 머리의 노출된 큐티클을 덮습니다.
매우 미세한 칼날을 사용하여, 코엘리에서 시작하여 각 측면 내측을 눈으로 자르기 시작하여 집게를 사용하여 쉽게 찢어질 수 있는 큐티클의 플랩을 형성하기 위해 머리 뒤쪽을 가로질러 큐티클을 잘라냅니다. 관심의 뇌 영역을 차단하 고 신중 하 게 어떤 기관의 등대 표면을 취소 하는 좋은 집게를 사용 하 여 어떤 과잉 큐티클을 제거, 뇌 조직 자체의 중단을 피하기 위해 주의. 조직 파편 영역을 지우기 위해 필요에 따라 링거의 용액을 제거하고 새로 고칩니다.
그리고 피하 악취 전달 바늘을 플라이의 머리로부터 약 1센티미터 떨어진 곳에 놓고, 안테나에 악취 전달을 방해할 수 있는 것은 아무것도 없다. 그런 다음 피하 악취 전달 바늘을 통해 이미징 챔버를 악취 전달 시스템에 연결합니다. 그리고 비행이 마취 및 수술에서 회복 10 분 허용합니다.
GFP 기반 칼슘 지표의 시각화를 위해 적외선 레이저가 장착된 다광 현미경의 레이저와 진동 격리 테이블에 설치된 수분 침지 목표를 920 나노미터의 난루 파장에 조정하고 GFP 밴드패스 필터를 설치합니다. 코스 Z 조정 노브를 사용하여 뇌의 Z 축을 스캔하여 관심있는 뇌 영역을 찾습니다. 자르기 함수를 사용하여 스캔 시간을 최소화하기 위해 관심 영역에만 스캐닝에 초점을 맞춥니다.
그리고 헤드의 전방이 아래쪽을 향하고 있도록 스캔 뷰를 회전합니다. 그런 다음 프레임 크기를 512x512픽셀로 조정하고 스캔할 영역을 선택합니다. 각 프레임에 대해 계산된 스캔 시간을 고려하여 최소 4개의 hertz의 프레임 속도를 달성합니다.
악취 유발 칼슘 과도 시각화의 경우 이미지 획득 소프트웨어 및 악취 전달 프로그램을 연결할 수 있는 미리 프로그래밍된 매크로 패키지를 시작하고 6.25초 동안 현미경 소프트웨어에서 측정을 시작하여 F0 기준값을 설정합니다. 악취 전달 시스템에서는, 특정 악취 컵 밸브의 개폐에 의해 트리거된 LED의 조명에 의해 여기에 표시된 2.5 초 악취 자극을 전달합니다. 냄새 오프셋의 끝에 기록의 12.5 초 뒤에.
그런 다음 동일한 방식으로 두 번째 및 세 번째 냄새에 대한 배달을 반복합니다. 이 설정에서 연관 컨디셔닝을 수행하려면 컴퓨터 제어 악취 전달 시스템을 사용하여 12 90 볼트 감전과 함께 60초 동안 조절된 자극-플러스 냄새를 제시합니다. 60초 의 휴식 후 감전없이 60 초 동안 조건부 자극 - 마이너스 - 냄새만 제시한다.
훈련 후 3분 후 사전 훈련 악취 자극 프로토콜을 반복하여 칼슘 과일성을 다시 측정한다. 그런 다음 이미징 파일을 나중에 이미지 분석을 위한 적절한 형식으로 저장합니다. 여기서 대표적인 버섯 체출력 뉴런 이미지는, 입증된 바와 같이 획득하여 관찰될 수 있다.
뉴런의 축축구에서 발현되지 않는 dHomer-GCaMP3 센서의 특이적 구획식 발현은 수지상 구획에서 정점 신호를 나타낸다. 명확한 진폭 냄새 반응은 세포성 GCaMP6f를 표현하는 파리에 비해 dHomer-GCaMp3을 표현하는 파리에서 관찰 될 수 있습니다. 여기서, 한 개별 비행의 대표적인 칼슘 흔적은 개별적인 준비 사이에서 얻을 수 있는 소음 수준 및 진폭의 차이를 보여줍니다.
이 기술은 하위 셀룰러 수준에서 시각화의 가능성을 열었습니다, 후각 표현이 변조되는 방법 및 컨디셔닝을 통해 메모리 단계가 형성되는 방법. 이러한 실험은 버섯 몸과 같은 복잡한 뇌 구조에 대한 우리의 이해를 확장하고, 연관 기억이 뉴런의 분산 된 인구에 걸쳐 저장하는 방법을 특성화하는 것이 중요 할 것이다.
