우리는이 원고의 준비 기간 동안 지원 로라 Bampton, 알렉스 데이비슨, 리차드 파튼, 아리타 아차에 감사하고 있습니다; 계란 활성화에 대한 토론 마리아나 Wolfner; 영상 지원을위한 매트 WAYLAND; 그리고 할머니 후 실험실에서 일반적으로 지원. 이 작품은 TTW 캠브리지, ISSF 대학 [허가 번호 097814]에 의해 지원되었다.

주의 : 다른 언급이없는 한 실온에서의 모든 단계를 수행. 1. 해부 준비 참고 : 여기에 설명 된 단계는 E. Gavis, 프린스턴 대학 &amp; 웨일 등에 따라 있습니다. 알. 18. 촬영하기 전에 다음 단계 이일을 수행합니다. <ol><li> 고형 식품의 약 10 ㎖를 함유하는 바이알 플라이를 가지고 하나의 코너 건조 효모를 소량 추가 1g 미만으로 충분하다. 참고 : 플라이 유리 병이나 음식에 대한 정보는 &#39;초파리 유지 보수&#39;(19)을 참조하십시오. </li><li> 효모를 수화 물 3 방울 - 1을 추가합니다. </li><li> 45 ° 각도로 옆으로 병을 설정하고 3 수 - 물을 차지하기 위해 효모 5 분. </li><li> 효모가 물을 흡수하는 동안, (최근에 등장하는 (GCaMP5라고 함) myristoy을 욕조-VP16GAL4에 의해 구동 UASt- MYR의 GCaMP5 (20)을 표현하는 파리의 병을 선택GCaMP5의 lated 양식) 난자의 세포막에 GECI 테 더링을 통해 대 잡음비가 높은 신호를 제공하도록 선택되었다. </li><li> CO 2 가스 병에 파리를 마취. 젖은 음식에 파리를 상실하지 않도록 반전 병을 유지해야합니다. </li><li> 공동 2 패드 위에 마취 파리 팁과 정렬 10-15 여성과 해부 현미경으로 붓을 사용하여 5 명의 남성. 참고 : 해부 건강한 여성을 제공하는 남성을 포함하는 표준입니다. </li><li> 단계 130에서 바이알이 준비되면, 바이알에 선택된 파리를 추가한다. 파리가 활성화 될 때까지 바이알 수평을 유지하도록주의하십시오. </li><li> 약 36 시간 동안 25 ° C에서 병을 놓습니다. </li><li> 병 또는 폐기에 대한 CO 2 패드에 남아있는 파리를 돌려줍니다. </li></ol> 2. 해부 초파리 난소 참고 : 여기에 설명 된 단계는 웨일 등에 따라 있습니다. 알. <s&gt; 18입니다. <ol><li> 36 시간 후, CO 2와 yeasted 유리 병에서 파리를 마취시키다. </li><li> 유리 병 안에 파리가 CO 2 패드에 그들을 팁 마취되면 해부 현미경 페인트 브러시로 분류된다. </li><li> 여성을 선택합니다. </li><li> 여성에서 두 개의 난소를 분리합니다. 전체 상세한 프로토콜의 웨일 등을 참조하십시오. 알. 18. 요약하자면: <ol><li> 호 1.5, 22 X 40mm의 coverslip에에 산소 할로 카본 오일 (시리즈 95)의 작은 방울을 넣습니다. </li><li> 복부의 앞쪽에 집게와 함께 여성을 잡고. </li><li> 해부 현미경으로 여성을 잡고 부드럽게 여성의 후방을 제거하기 위해 집게의 두 번째 세트를 사용합니다. </li><li> 두 번째 포셉의 후방 조직을 닦아냅니다. </li><li> 복부의 후방에 전방에서 두 번째 집게로 복부 구멍에 꽉. 두 불투명 난소 때 FEMA의 외부 집게에 충실해야르. </li><li> 오일에 난소를 터치합니다. </li><li> 포셉을 닦아 포셉에서 어떤 조직을 제거합니다. </li><li> 일 파리에서 세 된 커버를 얻기 위해 각 포함 난소 - 다음 단계 (2.4.7 2.4.1)를 반복합니다. </li></ol></li></ol> 3. 분리 개인 성숙한 계란 <ol><li> 단계 2.4에서 첫 번째 커버 슬립에, 4X로 설정 배율 표준 해부 현미경에서 난관을 찢어하여 두 개의 난소를 분리합니다. </li><li> 모든 계란 챔버에 구멍 않도록주의하면서, 하나의 난소의 중심에 폐쇄 포셉 한 쌍을 소개합니다. </li><li> 다음 닫힌 집게로 난소의 중심에 표준 해부 프로브를 삽입합니다. </li><li> 조심스럽게 성숙한 계란 (단계 14 달걀 챔버)가 위치하는 후방 극으로 난소를 통해 해부 프로브를 끕니다. </li><li> 반복 3.1 단계 - 3.4 2-5 시간은 난소 및 계란의 수의 크기에 따라. 주 : CO 2의 추 </서브&gt; 일반적으로 미리 증착 된 달걀보다 상승 등의 부속에 크게 표시하는 단일 계란의 증착이 발생합니다. 이미 여성의 내부에 활성화되어 있기 때문에이 계란은 이미징 폐기해야합니다. 참고 : 성숙한 계란은 난소 결합 조직에서 쉽게 분리 할 가능성이 높다. </li><li> 더 성숙한 계란은 난소의 외부에서 볼 수없는 경우, 해부 프로브를 괴롭 히고 부드럽게 계속합니다. </li><li> 커버 슬립의 중심에 선 5 - 성숙한 계란은 난소의 외부 커버 슬립에 볼 수 있습니다되면, 3으로 이동합니다. 참고 : 최상의 결과를 얻으려면, 계란의 측면을 따라 부드럽게 프로브를 실행합니다. 참고 :이 계란을 손상시킬 수로 등의 부속 당겨하지 마십시오. 참고 : 미래 영상 설정에 따라 최대 이미징 영역에 대한 커버 슬립에 수직으로 약 200 μm의 떨어져 계란을 맞 춥니 다. </li><li> 정렬 된 후에는 F를 사용하여 정렬 된 계란에서 멀리 드래그하여 난소 조직의 나머지 부분을 제거orceps. </li><li> 의료 와이프의 모서리에 뿌리며 마치로 여분의 기름을 제거합니다. 의료가 손실됩니다 접촉 성숙 난자를 닦아와 성숙한 계란을 만지지 않도록주의한다. </li><li> 현미경 샘플의 위치를​​ 단순화하기 위해 마커로 커버 슬립에 십자선을 그립니다. </li><li> 안전한 장소에 커버 슬립을 설정하고 5 휴식을 커버 슬립에 준비된 달걀 챔버를 남겨 - 10 분. 계란은 기름에 정착하기 위해이 있습니다. 샘플은 1 시간 후 해부까지 사용할 수 있습니다. </li><li> 그들에 난소와 커버 슬립의 나머지 3.11 - 반복 3.1 단계를 반복합니다. </li></ol> 4. 이미징 준비 <ol><li> 실온으로 준비 활성화 버퍼 (15)를 가져옵니다. 참고 : 활성화 버퍼는 저장성 버퍼이다 : 3.3 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 16.6 mM의 KH 2 PO 4, 10 mM의 염화나트륨, 50 mM의 KCl을 1로 pH 6.4로 가져, 5 % 폴리에틸렌 글리콜 8000, 2 mM의 염화칼슘 2 : NaOH를 5 비율 : KOH.자세한 내용은 Mahowald, 1983 참조 (15). 활성화 버퍼의 분취 량은 최대 2 주 동안 C 달 동안 4 °에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 이미징 시설에 준비 된 커버, 활성화 버퍼와 유리 피펫을 전송. 참고 : 넓은 필드, 공 초점, 회전하는 디스크 또는 광 시트 현미경을 사용할 수 있습니다. 우리는 거꾸로 현미경을 사용하는 것이 좋습니다. 우리의 대표적인 결과는 공 초점 현미경을 사용하여 얻었다. </li><li> 전체 성숙 난자를 영상화에 적합한 목적은 (여기 : 20X 0.7 NA)를 선택해야합니다. </li><li> 현미경 스테이지의 첫 번째 준비 커버 슬립을 마운트합니다. 무대에 커버 슬립을 깰 않도록주의하십시오. </li><li> 질적 활성화를위한 성숙한 계란 챔버와보기의 필드를 선택합니다. 이미지 구멍 계란 챔버 또는 막에에 blebbing와 그하지 마십시오. 참고 : 단계 4.6 - 4.7, 소프트웨어 명령 현미경 및 제조 업체에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 설정 이미징 파라(- 580 내지 500 nm) 표준 GFP 여​​기 (488 ㎚) 및 배출을위한 미터 거리에 있습니다. 또한 성숙한 계란과 변위 기름을 시각화하고 배향하기 위해 밝은 필드 뷰를 설정합니다. </li><li> 전체 Z - 스택을 성숙 계란이 볼 수있는 가장 낮은 Z-평면을 선택하고 설정하는 단계 당 40 μm의 약 2 μm의에 대해 수행한다. Z 스택 획득 사이에 지연이 없도록 매개 변수를 설정합니다. 약 30 분 동안 캡처하는 시간 시리즈를 설정합니다. </li></ol> 5. 이미징 예 생체 계란 활성화 <ol><li> 이미지 캡처를 시작합니다. </li><li> 2 완전 Z-스택을 취득 할 수 - 1 기다립니다. 이것은 활성화하기 전에 성숙 난자를 보여줍니다. </li><li> 유리 피펫으로 활성화 버퍼의 약 300 μl를 철회. </li><li> 그것이 성숙 난자 이미지화되는 바로 위에까지 커버 슬립 위에서 45도 각도로 활성 버퍼를 포함하는 유리 피펫의 끝을 위치 천천히 빔 경로에 피펫을 이동. 유리 피펫해야오일 위 2cm - 1 일. </li><li> 유리 피펫에서보다 5 초에 활성화 버퍼 2 방울 - 1을 추가합니다. 이 오일을 대체한다. 초과 활성화 버퍼를 추가하거나 성숙 난자의 변위를 일으킬 수있는 유리 피펫 계란을 만지지 마십시오. 이 목적과 커버 슬립 사이에 침지 기름에 형성 초점면 또는 기포의 변화를 일으킬 수있는 피펫으로 coverslip에 닿지 않도록주의하십시오. </li><li> 화상 취득 동안에 활성화 완충액을 첨가하는 동안, 오일이 활성화 완충액으로 치환되었음을 확인하기 위해 시야 채널을 확인한다. 참고 :이 처음으로 인해 빔 경로를 차단 피펫에 그림자로 나타납니다뿐만 아니라 작은 기름 방울의 모양에 발생합니다. 일부 기름 방울 실험 결과와 이미지 품질에 영향을 미칠 성숙한 난자와 관련된 상태를 유지 할 수 있습니다. </li><li> 5 - 오일이 활성화 버퍼 반복의 초기 또한 변위되지 않은 경우 5.4 단계0.6. </li><li> 오일을 성공적으로 변위되면, 시계열이 완료 될 때까지 실행하도록 허용한다. 참고 : 활성화에 난자의 붓기에, 일부 계란 챔버가 활성화 버퍼의 추가에 초점면 또는 시야에서 극적으로 이동합니다 인해. 이러한 상황에서, 획득을 중단하고 다음의 커버 슬립을 장착. </li><li> 이미지 시퀀스가​​ 인수를 완료 한 후, 데이터를 저장합니다. </li></ol> 6. 후 획득 이미지 처리 <ol><li> 피지 (http://fiji.sc/Downloads#Fiji) 또는 등가의 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 데이터 세트를 열고 분석 관련 파일을 선택한다. </li><li> 수집 된 데이터의 투영을 구축하기 위해 선택 : 이미지&gt; 스택&gt; Z-프로젝트를. </li><li> 시작 Z 슬라이스 및 정지 Z 슬라이스, 일반적으로 전체 섹션을 선택합니다. 일반적으로 &#39;최대 강도로 설정 투사형을 선택한다. 전체 시리즈에 선택한 설정을 적용 틱 상자 &#39;모든 시간 프레임&#39;을 선택합니다. </li><li> 만약하나 이상의 형광 채널은 복합을, 색상 간의 이동을 가능하도록 채널 도구를 사용하거나 이미지 그레이 스케일을, 몇 군데있다. 선택 이미지&gt; 색상&gt; 채널 도구입니다. </li><li> 이미지의 밝기를 조정하고 이미지를 선택 대비&gt;&gt; 밝기 / 대비를 조정합니다. </li><li> 하나의 이미지를 내보내려면, 관련 프레임을 선택 파일&gt; 다른 이름으로 저장&gt; JPEG, 또는 원하는 형식으로 날짜 표시 줄 슬라이더를 이동합니다. </li><li> 내 보낸 파일의 위치와 제목을 선택하고 저장합니다. 이미징 소프트웨어의 프레임 속도를 참고 화상에 타임 스탬프를 제공해야한다. </li><li> 동영상으로 시계열을 내보내려면 선택 파일&gt; 다른 이름으로 저장&gt; AVI는, 다음 (~ 초당 7 프레임) 프레임 속도를 선택합니다. </li><li> 내 보낸 파일의 위치와 제목을 선택하고 저장합니다. </li><li> 피지 형식으로 조정 된 파일을 저장하려면 파일&gt; 저장을 선택합니다. </li></ol>

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The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable. 
Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca2+ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol. 
Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer. 
This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited 13, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization. 
There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca2+ wave in mutant backgrounds 14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca2+ wave.

계란 (난자) 활성화에서의 세포 내 칼슘의 변화 2+ 농도는 모든 연구 생물 1, 2의 보존 구성 요소입니다. 이 이벤트는 세포주기의 재개 및 저장의 mRNA의 번역을 포함한 칼슘 의존적 공정의 넓은 범위를 개시한다. 때문에 세포 내 칼슘 농도의 일시적인 변화를 시각화 칼슘이 요구 사항에 주요 관심이었다. 역사적으로, 모델 생물은 알의 크기와 가용성에 따라 계란 활성화에 대한 연구에 선정되었다. 다양한 시각화 방법을 포함 이러한 시스템에서 2 + 농도에 따라 세포 내 칼슘의 변화를 정량화하기 위해 사용되었습니다 송사리 3의 광 단백질의 쿼린을; 등의 Fura-2 성게와 햄스터 4,5에서와 같이 칼슘 민감한 형광 염료; 칼슘 - 녹색 1 덱스 트란 Xenopus의 6인치 생성 및 유전자 인코딩 칼슘 지표 (GECIs)의 개선은 생체 내 7에 칼슘을 2 + 역학을 시각화 할 수있는 능력을 변형시켰다. 이러한 유전자 구조물은 특정 조직에서 발현 및 조직 침윤성 제제 8에 대한 필요성을 제한한다. GCaMPs 인해 높은 칼슘 친화력 매우 효과적이었다 GECIs의 녹색 형광 단백질 (GFP) 기반 클래스이며, 신호 - 대 - 잡음 비율 및 용량 9-11을 정의한다. 칼슘의 존재에서, GCaMP 착체, 칼 모듈 린에 칼슘의 결합으로 시작하고, 형태 적 변화를 겪는다 시리즈 그 GFP 성분 (9)의 형광 강도 향상을 초래한다. GCaMPs 광범위 세포 내 칼슘 (12)의 변화를 시각화하기 위해 초파리 신경 세포에 대한 연구에 사용되어왔다. 최근 applicati에성숙한 초파리 계란 2 + 칼슘을 시각화하는 GCaMP 기술에 계란 활성화 (13, 14)에서 단일 과도 칼슘 파를 밝혔다. 칼슘 2 + 웨이브는 생체 활성 분석 (13, 14)를 사용하여 생체 (13)에 배란 동안이나 높은 배율에서 낮은 배율로 시각화 할 수 있습니다. 생체 외 분석에서, 각각의 성숙 난자가 난소로부터 단리 및 저장성 용액을 사용하여 활성화되는, 생체 활성 15-17 사건 요점을 되풀이하는 것으로 나타났다 활성화 완충액이라. 이 생체 분석은 약물 중단, 물리적 조작과 유전자 돌연변이 등 다양한 실험 조건에서 칼슘 2 + 파의 쉬운 고해상도 시각화 할 수 있습니다. 이 문서에서는 생체 활성화 및 일에 대한 성숙한 초파리 계란의 준비를 보여줍니다GCaMP를 사용하여 칼슘 파를 시각화하는 데 사용되는 전자 후속 현미경. 이 방법은 칼슘 파의 개시 및 제어를 테스트하기 위해 하류 결과를 조사하는데 사용될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="999">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry active yeast</td>
			<td style="width:373px;">Fleischman&#8217;s</td>
			<td style="width:243px;">#2192</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>Various will work</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lamp</td>
			<td>Mircotec Fibre optic</td>
			<td>MF0-90</td>
			<td>Various will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Medical wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Corporation</td>
			<td>KLEW3020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Marker pen</td>
			<td>Stabilo</td>
			<td>841/46</td>
			<td>OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 pad</td>
			<td>&#160;Genesee Scientific</td>
			<td>59-114 (789060 Dutscher)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slip No. 1.5, 22 x 50mm</td>
			<td>International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td>
			<td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;">Halocarbon oil, series 95</td>
			<td rowspan="2">Halocarbon Products Corp.</td>
			<td>Distributor in Europe:</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Solvadis (GMBH)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oil 10 S</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td align="right">24627.188</td>
			<td>Can be used instead of Halocarbon oil, series 95</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Probe</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10140-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass pipette</td>
			<td>Fisherbrand,</td>
			<td>FB50251</td>
			<td>Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150mm length&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vial</td>
			<td style="width:373px;">Regina Industries</td>
			<td style="width:243px;">P1014</td>
			<td>GPPS&#160; 80mm x 25mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging calcium in drosophila at egg activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

여기에서 우리는 생체 활성화 성숙한 초파리 계란을 준비하는 방법을 설명했다. 2 + 역학 계란 활성화에 칼슘의 GECI 수 있도록 이미징 및 배아 발달의 시작 (그림 1) 표현 계란입니다. GCaMP에 의존하는 것은 특별히 미리 스토 일 그룹의 존재는, 결과가 약간의 질적 차이 (13) (14)을 가지고 있고, 사용하는 것을 주목해야한다. 우리는 또한 액틴 중합 억제제의 첨가에 의해 난자 활성화 중에 기능성 액틴의 역할을 입증 한 사이토 D, 활성화 버퍼 (그림 2) 14. 계란 활성화의 세포 골격에 대한 요구 사항은 보존된다. C.에서 엘레는 시비 다음, 세포 골격 성분은 제 21,22 비대칭 분할을위한 하나의 세포 수정란을 제조 재구성된다. cytoskele의 성게에서, 중단탈 활성화 다음 다시 조직 수축성 고리 형성 (23)을 차단하여 세포주기에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 칼슘 파도와 초파리 계란 활성화에 다운 스트림 기능을 매개 굴지의 역할은 완전히 밝혀지지 남아있다. 초파리에서, 칼슘 파도 액틴 세포 골격의 공동 시각화이 생체 활성 분석을 이용하여 달성 될 수있다. 여러 채널의 시계열을 획득 할 수 있고, 세포 내 칼슘의 역학 난자 (도 3)에서 액틴 조직의 변화와 일치 될 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> 그림 1 :. 생체의 초파리 계란 활성화 시간 시리즈에서 단일 칼슘 웨이브는 후속 UASt- myrGCaMP5을 표현하는 초파리 달걀 성숙활성화 완충액 (AH)의 ddition. 세포질 칼슘의 증가는 2 + 약 1.5 μm의 / 초 평균 속도와 극부 (B) 및 전파 (BF)에서 유래. 파형의 개시는 일반적으로 활성화 완충액 첨가가 3 분 내에 관찰되었다. 활성화 후, 성숙한 난자의 세포 내 칼슘 농도는 레벨 (G, H) - 활성화 프리 되돌아 간다. 보충 영화 1 (총 시간 33 분)를 참조하십시오. 스케일 바는 50 μm의 =. 최대 투사 40 μm의 =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> 그림 2 : 활성화 버퍼 교란 칼슘에 사이토 칼라 D의 추가2 + 웨이브 전파. 생체의 시간 시리즈는 10 μg의 / ㎖의 사이토 D 최종 농도 (AH)를 포함 활성화 버퍼 또한 다음 UASt- myrGCaMP5을 표현하는 초파리의 알을 성숙. 칼슘 2+ 파 극부 (A)에서 개시되는 동안,이 손상되고, 난자 (F)의 앞쪽에 도달하지 않는다 (백색 화살촉 웨이브의 전면을 나타낸다). 더 이상의 칼슘 변경) 30 분에 걸쳐 관찰되지 않았다. 보충 영화 2 (총 시간 30 분)을 참조하십시오. 스케일 바는 50 μm의 =. 최대 투사 40 μm의 =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> 그림 3 : E에서 액틴과 칼슘의 공동 시각화생체의 초파리. 시간 시리즈 GG 정품 인증은 UASt- myrGCaMP5 (시안) 및 UASp -F-Tractin.tdTomato (마젠타) 활성화 버퍼의 다음과 같은 추가 (AH)를 표현하는 초파리의 알을 성숙. 칼슘 2 + 파가 극부에서 시작하고 그림에서와 같이 복구 1. 액틴, 흰색 화살촉 (H 대 A) 시간이 지남에 따라 변화하는 것으로 보인다. 성숙한 계란의 중심 칼슘 신호 검출의 부족은 촬상시의 시료의 이동에 기인한다. 스케일 바는 50 μm의 =. 최대 투사 40 μm의 =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

이 문서에서는 초파리 계란 활성화 중에 2 + 칼슘을 시각화에 대한 적응력 생체 프로토콜을 설명합니다.

에서 이미징 칼슘<em&gt; 초파리</em&gt; 계란 활성화에

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

imaging-calcium-in-drosophila-at-egg-activation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

7.8K 조회수.  University of Cambridge.  이 문서에서는 초파리 계란 활성화 중에 2 + 칼슘을 시각화에 대한 적응력 생체 프로토콜을 설명합니다. 

비디오: Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 번데기 눈

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

연구

발생학

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

의 수직 이미지<em&gt; 초파리</em&gt; 계란 챔버

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

방법은 림프 글 랜드와 혈구 세포에서를 검사합니다<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

장기의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 아이 디스크

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

Vivo에서 근육-힘 줄 Morphogenesis 초파리 번데기에의 이미징

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

배양 된 초파리 계란 챔버의 시간 경과 영화를 사용하여 로컬 세포 및 조직 저울에서 Actomyosin 역학분석

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

초파리 배아에서 근육 수축의 라이브 이미징 및 분석

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

녹고, 경작, 그리고 초파리 셀 라인 Cryopreserving

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

제노푸스 라에비스의 신경 전구체 특성화를 위한 형광 칼슘 이미징 및 후속 시토 혼성화

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...