Name: imaging calcium in drosophila at egg activation
Uploaded: 2016-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation at JoVE.com

우리는이 원고의 준비 기간 동안 지원 로라 Bampton, 알렉스 데이비슨, 리차드 파튼, 아리타 아차에 감사하고 있습니다; 계란 활성화에 대한 토론 마리아나 Wolfner; 영상 지원을위한 매트 WAYLAND; 그리고 할머니 후 실험실에서 일반적으로 지원. 이 작품은 TTW 캠브리지, ISSF 대학 [허가 번호 097814]에 의해 지원되었다.

주의 : 다른 언급이없는 한 실온에서의 모든 단계를 수행. 1. 해부 준비 참고 : 여기에 설명 된 단계는 E. Gavis, 프린스턴 대학 &amp; 웨일 등에 따라 있습니다. 알. 18. 촬영하기 전에 다음 단계 이일을 수행합니다. <ol><li> 고형 식품의 약 10 ㎖를 함유하는 바이알 플라이를 가지고 하나의 코너 건조 효모를 소량 추가 1g 미만으로 충분하다. 참고 : 플라이 유리 병이나 음식에 대한 정보는 &#39;초파리 유지 보수&#39;(19)을 참조하십시오. </li><li> 효모를 수화 물 3 방울 - 1을 추가합니다. </li><li> 45 ° 각도로 옆으로 병을 설정하고 3 수 - 물을 차지하기 위해 효모 5 분. </li><li> 효모가 물을 흡수하는 동안, (최근에 등장하는 (GCaMP5라고 함) myristoy을 욕조-VP16GAL4에 의해 구동 UASt- MYR의 GCaMP5 (20)을 표현하는 파리의 병을 선택GCaMP5의 lated 양식) 난자의 세포막에 GECI 테 더링을 통해 대 잡음비가 높은 신호를 제공하도록 선택되었다. </li><li> CO 2 가스 병에 파리를 마취. 젖은 음식에 파리를 상실하지 않도록 반전 병을 유지해야합니다. </li><li> 공동 2 패드 위에 마취 파리 팁과 정렬 10-15 여성과 해부 현미경으로 붓을 사용하여 5 명의 남성. 참고 : 해부 건강한 여성을 제공하는 남성을 포함하는 표준입니다. </li><li> 단계 130에서 바이알이 준비되면, 바이알에 선택된 파리를 추가한다. 파리가 활성화 될 때까지 바이알 수평을 유지하도록주의하십시오. </li><li> 약 36 시간 동안 25 ° C에서 병을 놓습니다. </li><li> 병 또는 폐기에 대한 CO 2 패드에 남아있는 파리를 돌려줍니다. </li></ol> 2. 해부 초파리 난소 참고 : 여기에 설명 된 단계는 웨일 등에 따라 있습니다. 알. <s&gt; 18입니다. <ol><li> 36 시간 후, CO 2와 yeasted 유리 병에서 파리를 마취시키다. </li><li> 유리 병 안에 파리가 CO 2 패드에 그들을 팁 마취되면 해부 현미경 페인트 브러시로 분류된다. </li><li> 여성을 선택합니다. </li><li> 여성에서 두 개의 난소를 분리합니다. 전체 상세한 프로토콜의 웨일 등을 참조하십시오. 알. 18. 요약하자면: <ol><li> 호 1.5, 22 X 40mm의 coverslip에에 산소 할로 카본 오일 (시리즈 95)의 작은 방울을 넣습니다. </li><li> 복부의 앞쪽에 집게와 함께 여성을 잡고. </li><li> 해부 현미경으로 여성을 잡고 부드럽게 여성의 후방을 제거하기 위해 집게의 두 번째 세트를 사용합니다. </li><li> 두 번째 포셉의 후방 조직을 닦아냅니다. </li><li> 복부의 후방에 전방에서 두 번째 집게로 복부 구멍에 꽉. 두 불투명 난소 때 FEMA의 외부 집게에 충실해야르. </li><li> 오일에 난소를 터치합니다. </li><li> 포셉을 닦아 포셉에서 어떤 조직을 제거합니다. </li><li> 일 파리에서 세 된 커버를 얻기 위해 각 포함 난소 - 다음 단계 (2.4.7 2.4.1)를 반복합니다. </li></ol></li></ol> 3. 분리 개인 성숙한 계란 <ol><li> 단계 2.4에서 첫 번째 커버 슬립에, 4X로 설정 배율 표준 해부 현미경에서 난관을 찢어하여 두 개의 난소를 분리합니다. </li><li> 모든 계란 챔버에 구멍 않도록주의하면서, 하나의 난소의 중심에 폐쇄 포셉 한 쌍을 소개합니다. </li><li> 다음 닫힌 집게로 난소의 중심에 표준 해부 프로브를 삽입합니다. </li><li> 조심스럽게 성숙한 계란 (단계 14 달걀 챔버)가 위치하는 후방 극으로 난소를 통해 해부 프로브를 끕니다. </li><li> 반복 3.1 단계 - 3.4 2-5 시간은 난소 및 계란의 수의 크기에 따라. 주 : CO 2의 추 </서브&gt; 일반적으로 미리 증착 된 달걀보다 상승 등의 부속에 크게 표시하는 단일 계란의 증착이 발생합니다. 이미 여성의 내부에 활성화되어 있기 때문에이 계란은 이미징 폐기해야합니다. 참고 : 성숙한 계란은 난소 결합 조직에서 쉽게 분리 할 가능성이 높다. </li><li> 더 성숙한 계란은 난소의 외부에서 볼 수없는 경우, 해부 프로브를 괴롭 히고 부드럽게 계속합니다. </li><li> 커버 슬립의 중심에 선 5 - 성숙한 계란은 난소의 외부 커버 슬립에 볼 수 있습니다되면, 3으로 이동합니다. 참고 : 최상의 결과를 얻으려면, 계란의 측면을 따라 부드럽게 프로브를 실행합니다. 참고 :이 계란을 손상시킬 수로 등의 부속 당겨하지 마십시오. 참고 : 미래 영상 설정에 따라 최대 이미징 영역에 대한 커버 슬립에 수직으로 약 200 μm의 떨어져 계란을 맞 춥니 다. </li><li> 정렬 된 후에는 F를 사용하여 정렬 된 계란에서 멀리 드래그하여 난소 조직의 나머지 부분을 제거orceps. </li><li> 의료 와이프의 모서리에 뿌리며 마치로 여분의 기름을 제거합니다. 의료가 손실됩니다 접촉 성숙 난자를 닦아와 성숙한 계란을 만지지 않도록주의한다. </li><li> 현미경 샘플의 위치를​​ 단순화하기 위해 마커로 커버 슬립에 십자선을 그립니다. </li><li> 안전한 장소에 커버 슬립을 설정하고 5 휴식을 커버 슬립에 준비된 달걀 챔버를 남겨 - 10 분. 계란은 기름에 정착하기 위해이 있습니다. 샘플은 1 시간 후 해부까지 사용할 수 있습니다. </li><li> 그들에 난소와 커버 슬립의 나머지 3.11 - 반복 3.1 단계를 반복합니다. </li></ol> 4. 이미징 준비 <ol><li> 실온으로 준비 활성화 버퍼 (15)를 가져옵니다. 참고 : 활성화 버퍼는 저장성 버퍼이다 : 3.3 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 16.6 mM의 KH 2 PO 4, 10 mM의 염화나트륨, 50 mM의 KCl을 1로 pH 6.4로 가져, 5 % 폴리에틸렌 글리콜 8000, 2 mM의 염화칼슘 2 : NaOH를 5 비율 : KOH.자세한 내용은 Mahowald, 1983 참조 (15). 활성화 버퍼의 분취 량은 최대 2 주 동안 C 달 동안 4 °에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 이미징 시설에 준비 된 커버, 활성화 버퍼와 유리 피펫을 전송. 참고 : 넓은 필드, 공 초점, 회전하는 디스크 또는 광 시트 현미경을 사용할 수 있습니다. 우리는 거꾸로 현미경을 사용하는 것이 좋습니다. 우리의 대표적인 결과는 공 초점 현미경을 사용하여 얻었다. </li><li> 전체 성숙 난자를 영상화에 적합한 목적은 (여기 : 20X 0.7 NA)를 선택해야합니다. </li><li> 현미경 스테이지의 첫 번째 준비 커버 슬립을 마운트합니다. 무대에 커버 슬립을 깰 않도록주의하십시오. </li><li> 질적 활성화를위한 성숙한 계란 챔버와보기의 필드를 선택합니다. 이미지 구멍 계란 챔버 또는 막에에 blebbing와 그하지 마십시오. 참고 : 단계 4.6 - 4.7, 소프트웨어 명령 현미경 및 제조 업체에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 설정 이미징 파라(- 580 내지 500 nm) 표준 GFP 여​​기 (488 ㎚) 및 배출을위한 미터 거리에 있습니다. 또한 성숙한 계란과 변위 기름을 시각화하고 배향하기 위해 밝은 필드 뷰를 설정합니다. </li><li> 전체 Z - 스택을 성숙 계란이 볼 수있는 가장 낮은 Z-평면을 선택하고 설정하는 단계 당 40 μm의 약 2 μm의에 대해 수행한다. Z 스택 획득 사이에 지연이 없도록 매개 변수를 설정합니다. 약 30 분 동안 캡처하는 시간 시리즈를 설정합니다. </li></ol> 5. 이미징 예 생체 계란 활성화 <ol><li> 이미지 캡처를 시작합니다. </li><li> 2 완전 Z-스택을 취득 할 수 - 1 기다립니다. 이것은 활성화하기 전에 성숙 난자를 보여줍니다. </li><li> 유리 피펫으로 활성화 버퍼의 약 300 μl를 철회. </li><li> 그것이 성숙 난자 이미지화되는 바로 위에까지 커버 슬립 위에서 45도 각도로 활성 버퍼를 포함하는 유리 피펫의 끝을 위치 천천히 빔 경로에 피펫을 이동. 유리 피펫해야오일 위 2cm - 1 일. </li><li> 유리 피펫에서보다 5 초에 활성화 버퍼 2 방울 - 1을 추가합니다. 이 오일을 대체한다. 초과 활성화 버퍼를 추가하거나 성숙 난자의 변위를 일으킬 수있는 유리 피펫 계란을 만지지 마십시오. 이 목적과 커버 슬립 사이에 침지 기름에 형성 초점면 또는 기포의 변화를 일으킬 수있는 피펫으로 coverslip에 닿지 않도록주의하십시오. </li><li> 화상 취득 동안에 활성화 완충액을 첨가하는 동안, 오일이 활성화 완충액으로 치환되었음을 확인하기 위해 시야 채널을 확인한다. 참고 :이 처음으로 인해 빔 경로를 차단 피펫에 그림자로 나타납니다뿐만 아니라 작은 기름 방울의 모양에 발생합니다. 일부 기름 방울 실험 결과와 이미지 품질에 영향을 미칠 성숙한 난자와 관련된 상태를 유지 할 수 있습니다. </li><li> 5 - 오일이 활성화 버퍼 반복의 초기 또한 변위되지 않은 경우 5.4 단계0.6. </li><li> 오일을 성공적으로 변위되면, 시계열이 완료 될 때까지 실행하도록 허용한다. 참고 : 활성화에 난자의 붓기에, 일부 계란 챔버가 활성화 버퍼의 추가에 초점면 또는 시야에서 극적으로 이동합니다 인해. 이러한 상황에서, 획득을 중단하고 다음의 커버 슬립을 장착. </li><li> 이미지 시퀀스가​​ 인수를 완료 한 후, 데이터를 저장합니다. </li></ol> 6. 후 획득 이미지 처리 <ol><li> 피지 (http://fiji.sc/Downloads#Fiji) 또는 등가의 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 데이터 세트를 열고 분석 관련 파일을 선택한다. </li><li> 수집 된 데이터의 투영을 구축하기 위해 선택 : 이미지&gt; 스택&gt; Z-프로젝트를. </li><li> 시작 Z 슬라이스 및 정지 Z 슬라이스, 일반적으로 전체 섹션을 선택합니다. 일반적으로 &#39;최대 강도로 설정 투사형을 선택한다. 전체 시리즈에 선택한 설정을 적용 틱 상자 &#39;모든 시간 프레임&#39;을 선택합니다. </li><li> 만약하나 이상의 형광 채널은 복합을, 색상 간의 이동을 가능하도록 채널 도구를 사용하거나 이미지 그레이 스케일을, 몇 군데있다. 선택 이미지&gt; 색상&gt; 채널 도구입니다. </li><li> 이미지의 밝기를 조정하고 이미지를 선택 대비&gt;&gt; 밝기 / 대비를 조정합니다. </li><li> 하나의 이미지를 내보내려면, 관련 프레임을 선택 파일&gt; 다른 이름으로 저장&gt; JPEG, 또는 원하는 형식으로 날짜 표시 줄 슬라이더를 이동합니다. </li><li> 내 보낸 파일의 위치와 제목을 선택하고 저장합니다. 이미징 소프트웨어의 프레임 속도를 참고 화상에 타임 스탬프를 제공해야한다. </li><li> 동영상으로 시계열을 내보내려면 선택 파일&gt; 다른 이름으로 저장&gt; AVI는, 다음 (~ 초당 7 프레임) 프레임 속도를 선택합니다. </li><li> 내 보낸 파일의 위치와 제목을 선택하고 저장합니다. </li><li> 피지 형식으로 조정 된 파일을 저장하려면 파일&gt; 저장을 선택합니다. </li></ol>

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The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable. 
Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca2+ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol. 
Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer. 
This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited 13, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization. 
There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca2+ wave in mutant backgrounds 14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca2+ wave.

계란 (난자) 활성화에서의 세포 내 칼슘의 변화 2+ 농도는 모든 연구 생물 1, 2의 보존 구성 요소입니다. 이 이벤트는 세포주기의 재개 및 저장의 mRNA의 번역을 포함한 칼슘 의존적 공정의 넓은 범위를 개시한다. 때문에 세포 내 칼슘 농도의 일시적인 변화를 시각화 칼슘이 요구 사항에 주요 관심이었다. 역사적으로, 모델 생물은 알의 크기와 가용성에 따라 계란 활성화에 대한 연구에 선정되었다. 다양한 시각화 방법을 포함 이러한 시스템에서 2 + 농도에 따라 세포 내 칼슘의 변화를 정량화하기 위해 사용되었습니다 송사리 3의 광 단백질의 쿼린을; 등의 Fura-2 성게와 햄스터 4,5에서와 같이 칼슘 민감한 형광 염료; 칼슘 - 녹색 1 덱스 트란 Xenopus의 6인치 생성 및 유전자 인코딩 칼슘 지표 (GECIs)의 개선은 생체 내 7에 칼슘을 2 + 역학을 시각화 할 수있는 능력을 변형시켰다. 이러한 유전자 구조물은 특정 조직에서 발현 및 조직 침윤성 제제 8에 대한 필요성을 제한한다. GCaMPs 인해 높은 칼슘 친화력 매우 효과적이었다 GECIs의 녹색 형광 단백질 (GFP) 기반 클래스이며, 신호 - 대 - 잡음 비율 및 용량 9-11을 정의한다. 칼슘의 존재에서, GCaMP 착체, 칼 모듈 린에 칼슘의 결합으로 시작하고, 형태 적 변화를 겪는다 시리즈 그 GFP 성분 (9)의 형광 강도 향상을 초래한다. GCaMPs 광범위 세포 내 칼슘 (12)의 변화를 시각화하기 위해 초파리 신경 세포에 대한 연구에 사용되어왔다. 최근 applicati에성숙한 초파리 계란 2 + 칼슘을 시각화하는 GCaMP 기술에 계란 활성화 (13, 14)에서 단일 과도 칼슘 파를 밝혔다. 칼슘 2 + 웨이브는 생체 활성 분석 (13, 14)를 사용하여 생체 (13)에 배란 동안이나 높은 배율에서 낮은 배율로 시각화 할 수 있습니다. 생체 외 분석에서, 각각의 성숙 난자가 난소로부터 단리 및 저장성 용액을 사용하여 활성화되는, 생체 활성 15-17 사건 요점을 되풀이하는 것으로 나타났다 활성화 완충액이라. 이 생체 분석은 약물 중단, 물리적 조작과 유전자 돌연변이 등 다양한 실험 조건에서 칼슘 2 + 파의 쉬운 고해상도 시각화 할 수 있습니다. 이 문서에서는 생체 활성화 및 일에 대한 성숙한 초파리 계란의 준비를 보여줍니다GCaMP를 사용하여 칼슘 파를 시각화하는 데 사용되는 전자 후속 현미경. 이 방법은 칼슘 파의 개시 및 제어를 테스트하기 위해 하류 결과를 조사하는데 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Dry active yeast</td><td>Fleischman&amp;rsquo;s</td><td>#2192</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>Various will work</td></tr><tr><td>Lamp</td><td>Mircotec Fibre optic</td><td>MF0-90</td><td>Various will work</td></tr><tr><td>Medical wipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>KLEW3020&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marker pen</td><td>Stabilo</td><td>841/46</td><td>OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4 mm</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; pad</td><td>&amp;nbsp;Genesee Scientific</td><td>59-114 (789060 Dutscher)</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip No. 1.5, 22 x 50 mm</td><td>International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td><td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon oil, series 95</td><td>Halocarbon Products Corp.</td><td>Distributor in Europe:</td><td></td></tr><tr><td>Solvadis (GMBH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oil 10 S</td><td>VWR Chemicals</td><td>24627.188</td><td>Can be used instead of Halocarbon oil, series 95</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.</td></tr><tr><td>Probe</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-01</td><td></td></tr><tr><td>Glass pipette</td><td>Fisherbrand,</td><td>FB50251</td><td>Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150 mm length&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vial</td><td>Regina Industries</td><td>P1014</td><td>GPPS&amp;nbsp; 80 mm x 25 mm</td></tr></tbody></table>

imaging calcium in drosophila at egg activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

여기에서 우리는 생체 활성화 성숙한 초파리 계란을 준비하는 방법을 설명했다. 2 + 역학 계란 활성화에 칼슘의 GECI 수 있도록 이미징 및 배아 발달의 시작 (그림 1) 표현 계란입니다. GCaMP에 의존하는 것은 특별히 미리 스토 일 그룹의 존재는, 결과가 약간의 질적 차이 (13) (14)을 가지고 있고, 사용하는 것을 주목해야한다. 우리는 또한 액틴 중합 억제제의 첨가에 의해 난자 활성화 중에 기능성 액틴의 역할을 입증 한 사이토 D, 활성화 버퍼 (그림 2) 14. 계란 활성화의 세포 골격에 대한 요구 사항은 보존된다. C.에서 엘레는 시비 다음, 세포 골격 성분은 제 21,22 비대칭 분할을위한 하나의 세포 수정란을 제조 재구성된다. cytoskele의 성게에서, 중단탈 활성화 다음 다시 조직 수축성 고리 형성 (23)을 차단하여 세포주기에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 칼슘 파도와 초파리 계란 활성화에 다운 스트림 기능을 매개 굴지의 역할은 완전히 밝혀지지 남아있다. 초파리에서, 칼슘 파도 액틴 세포 골격의 공동 시각화이 생체 활성 분석을 이용하여 달성 될 수있다. 여러 채널의 시계열을 획득 할 수 있고, 세포 내 칼슘의 역학 난자 (도 3)에서 액틴 조직의 변화와 일치 될 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> 그림 1 :. 생체의 초파리 계란 활성화 시간 시리즈에서 단일 칼슘 웨이브는 후속 UASt- myrGCaMP5을 표현하는 초파리 달걀 성숙활성화 완충액 (AH)의 ddition. 세포질 칼슘의 증가는 2 + 약 1.5 μm의 / 초 평균 속도와 극부 (B) 및 전파 (BF)에서 유래. 파형의 개시는 일반적으로 활성화 완충액 첨가가 3 분 내에 관찰되었다. 활성화 후, 성숙한 난자의 세포 내 칼슘 농도는 레벨 (G, H) - 활성화 프리 되돌아 간다. 보충 영화 1 (총 시간 33 분)를 참조하십시오. 스케일 바는 50 μm의 =. 최대 투사 40 μm의 =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> 그림 2 : 활성화 버퍼 교란 칼슘에 사이토 칼라 D의 추가2 + 웨이브 전파. 생체의 시간 시리즈는 10 μg의 / ㎖의 사이토 D 최종 농도 (AH)를 포함 활성화 버퍼 또한 다음 UASt- myrGCaMP5을 표현하는 초파리의 알을 성숙. 칼슘 2+ 파 극부 (A)에서 개시되는 동안,이 손상되고, 난자 (F)의 앞쪽에 도달하지 않는다 (백색 화살촉 웨이브의 전면을 나타낸다). 더 이상의 칼슘 변경) 30 분에 걸쳐 관찰되지 않았다. 보충 영화 2 (총 시간 30 분)을 참조하십시오. 스케일 바는 50 μm의 =. 최대 투사 40 μm의 =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> 그림 3 : E에서 액틴과 칼슘의 공동 시각화생체의 초파리. 시간 시리즈 GG 정품 인증은 UASt- myrGCaMP5 (시안) 및 UASp -F-Tractin.tdTomato (마젠타) 활성화 버퍼의 다음과 같은 추가 (AH)를 표현하는 초파리의 알을 성숙. 칼슘 2 + 파가 극부에서 시작하고 그림에서와 같이 복구 1. 액틴, 흰색 화살촉 (H 대 A) 시간이 지남에 따라 변화하는 것으로 보인다. 성숙한 계란의 중심 칼슘 신호 검출의 부족은 촬상시의 시료의 이동에 기인한다. 스케일 바는 50 μm의 =. 최대 투사 40 μm의 =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

이 문서에서는 초파리 계란 활성화 중에 2 + 칼슘을 시각화에 대한 적응력 생체 프로토콜을 설명합니다.

에서 이미징 칼슘<em&gt; 초파리</em&gt; 계란 활성화에

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

imaging-calcium-in-drosophila-at-egg-activation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

7.8K 조회수.  University of Cambridge.  이 문서에서는 초파리 계란 활성화 중에 2 + 칼슘을 시각화에 대한 적응력 생체 프로토콜을 설명합니다. 

비디오: Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

의 수직 이미지<em&gt; 초파리</em&gt; 계란 챔버

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

연구

발생학

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

의 냄새-evoked 응답의 칼슘 이미징 Drosophila Antennal 엽

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

신경과학

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and apoptosis, development and ageing, to neuronal synaptic plasticity and regeneration have been associated with Ryanodine receptors (RyRs). Despite the importance of calcium signaling, the exact mechanism of its function in early development is unclear. As an organism with a short gestational period, the embryos of Drosophila melanogaster are prime study subjects for investigating the distribution and localization of CICR associated proteins and their regulators during development. However, because of their lipid-rich embryos and chitin-rich chorion, their utility is limited by the difficulty of mounting embryos on glass surfaces. In this work, we introduce a practical protocol that significantly enhances the attachment of Drosophila embryo onto slides and detail methods for successful histochemistry, immunohistochemistry, and in-situ hybridization. The chrome alum gelatin slide-coating method and embryo pre-embedding method dramatically increases the yield in studying Drosophila embryo protein and RNA expression. To demonstrate this approach, we studied DmFKBP12/Calstabin, a well-known regulator of RyR during early embryonic development of Drosophila melanogaster. We identified DmFKBP12 in as early as the syncytial blastoderm stage and report the dynamic expression pattern of DmFKBP12 during development: initially as an evenly distributed protein in the syncytial blastoderm, then preliminarily localizing to the basement layer of the cortex during cellular blastoderm, before distributing in the primitive neuronal and digestion architecture during the three-gem layer phase in early gastrulation. This distribution may explain the critical role RyR plays in the vital organ systems that originate in from these layers: the suboesophageal and supraesophageal ganglion, ventral nervous system, and musculoskeletal system.

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Here, we describe a protocol for detection and localization of Drosophila embryo protein and RNA from collection to pre-embedding and embedding, immunostaining, and mRNA in situ hybridization.

초기 초파리 배아 내의 면역조직화학 및 RNA 계내 분포를 위한 프로토콜

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

Tracking Calcium in the Early Developmental Phases of C. elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode Caenorhabditis elegans provides several unique advantages for the study of the OET as it is transparent and has an ordered gonad that produces one mature oocyte every ~23 min at 20 &#176;C. We have modified the genetically encoded calcium indicator jGCaMP7s to fluorescently indicate the moment of fertilization within a living organism. We have termed this reporter &#34;CaFE&#34; for Calcium during Fertilization in C. elegans. The CaFE reporter was&#160;engineered into a safe harbor locus in single copy, has no significant impact on physiology or fecundity, and produces a robust signal upon fertilization. Here, a series of protocols is presented for utilizing the CaFE reporter as an in vivo tool for dissecting the OET and embryogenesis. We include methods to synchronize worms, examine the effects of RNAi knockdown, mount worms for imaging, and to visualize calcium in oocytes and embryos. Additionally, we present the generation of additional worm strains to aid in this type of analysis. Demonstrating the utility of the CaFE reporter to visualize the timing of fertilization, we report that double ovulation occurs when ipp-5 is targeted by RNAi and that only the first oocyte undergoes immediate fertilization. Furthermore, the discovery of single-cell calcium transients during early embryogenesis is reported here, demonstrating that the CaFE reporter persists into early development. Importantly, the CaFE reporter in worms is simple enough to use for incorporation into course-based undergraduate research (CURE) laboratory classes. The CaFE reporter, coupled with the ordered gonad and ease of RNAi in worms, facilitates inquiry into the cell-cell dynamics required to regulate internal fertilization and early embryogenesis.

Here, we present protocols and tools for visualizing calcium during fertilization and early embryogenesis using a genetically encoded calcium reporter expressed in the germline of the model nematode C. elegans.

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

초파리 멜라노가스터에서 학습 유발 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Calcium Imaging을 통한 Drosophila 의 간질형 이벤트 모니터링

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals worldwide. Despite the clinical importance of epilepsy, the functional analysis of neural activity in the central nervous system is still to be developed. Recent advancements in imaging technology, in combination with stable expression of genetically encoded calcium indicators, such as GCaMP6, have revolutionized the study of epilepsy at both brain-wide and single-cell resolution levels. Drosophila melanogaster has emerged as a tool for investigating the molecular and cellular mechanisms underlying epilepsy due to its sophisticated molecular genetics and behavioral assays. In this study, we present a novel and efficient protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The whole brain is prepared from cac, a well-known epilepsy gene, knockdown flies for calcium imaging with a confocal microscope to identify the neural activity as a follow-up to the bang-sensitive seizure-like behavior assay. The cac knockdown flies showed a higher rate of seizure-like behavior and abnormal calcium activities, including more large spikes and fewer small spikes than wild-type flies. The calcium activities were correlated to seizure-like behavior. This methodology serves as an efficient methodology in screening the pathogenic genes for epilepsy and exploring the potential mechanism of epilepsy at the cellular level.

저자 스포트라이트: 간질 연구의 최근 발전에 대한 기술 및 연구 결과에 대한 통찰력 

Here, we present a protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The protocol provides a valuable tool for investigating ictal events in adult Drosophila through ex vivo calcium imaging, allowing for exploration of the potential mechanisms of epilepsy at the cellular levels.

Ex Vivo (체외 주행) 간질의 초파리 모델을 위한 칼슘 영상

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...

Calcium Imaging in Individual Neurons Regulating Egg-Laying Behavior in Caenorhabditis elegans

Source: Ravi, B. et al., <a href="https://app.jove.com/v/56911">Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates a technique for calcium imaging in individual neurons of behaving Caenorhabditis elegans using genetically encoded fluorescent reporter proteins. It outlines the steps involved in imaging worm movement and measuring reporter fluorescence ratios from neurons to correlate intracellular calcium levels with neuronal activity and behavioral changes during egg-laying.

Calcium Imaging in individual neurons Regulating Egg-Laying Behavior in Caenorhabditis elegans(예쁜꼬마선충의 알을 낳는 행동을 조절하는 개별 뉴런의 칼슘 이미징)

1. Strains, Culture Media, and Mounting of Animals

	Grow&#160;C. elegans&#160;worms at 20 &#176;C on standard 60-mm Nematode Growth Medium (NGM) agar ...

에서 이미징 칼슘

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의 수직 이미지

의 냄새-evoked 응답의 칼슘 이미징 Drosophila Antennal 엽

초기 초파리 배아 내의 면역조직화학 및 RNA 계내 분포를 위한 프로토콜

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

초파리 멜라노가스터에서 학습 유발 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징

Ex Vivo (체외 주행) 간질의 초파리 모델을 위한 칼슘 영상

Ex Vivo (체외 주행) 간질의 초파리 모델을 위한 칼슘 영상

Ex Vivo (체외 주행) 간질의 초파리 모델을 위한 칼슘 영상

Calcium Imaging in individual neurons Regulating Egg-Laying Behavior in Caenorhabditis elegans(예쁜꼬마선충의 알을 낳는 행동을 조절하는 개별 뉴런의 칼슘 이미징)