우리는이 방법론, 그림 1에 도식의 사용을위한 마운트 블록 청사진과 다니엘라 Pelz를 그리기위한 파블로 Traversa의 개발에 Silke Sachse와 비테 Eisermann을 인정합니다. 우리는 Silke Sachse, Pavan Ramdya 및 원고에 대한 덧글에 대한 라파엘 Rytz에 감사합니다. R. 벨은 Boehringer Ingelheim 재단 박사 학위 원정대에 의해 지원됩니다. R. 벤톤의 연구실에서 연구는 독립적인 연구원 그랜트와 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)을 시작하는 유럽 연구 협의회에 의해 후원된다.

1. 마운팅 블록 어셈블리 <ol><li> 플렉시 글라스 장착 블록 (그림 1A)을 (에서 제공하는 청사진에 주어진 정확한 사양에 제출하여야한다 <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> ) 파리 쉽게 장착과 절개를 허용합니다. 뒤쪽에서 나사를 통해 스레드하지만 블록의 전면 넘어 그들을 연장하지 않으며 그들의 위치는 (2.7 참조​​) 동물의 준비 기간 동안 조정됩니다. </li><li> 정밀 드릴 사용하면,이 시점에서 블록의 두께를 줄이고, 파리의 시체를위한 공간을 만들기 위해 표면 아래 파고, 파리에 대한 원형 챔버의 위쪽 테두리의 발전을합니다. </li><li> 메스 직각으로 구리 격자를 잘라 &quot;칼라&quot;를 만들기 위해 슬릿의 하단으로 닫습니다. 이것은 파리의 삽입을하는 데 도움이되므로 두 가지 결과로 펄럭는 레벨 있는지 확인합니다. </li><li> 이쑤시개로 플라이를위한 순환 챔버 위의 마운팅 블록쪽으로 superglue의 작은 방울을 넣으십시오. 슬릿이 블록 (그림 1A)를 중심으로되도록 접착제와 위치를 향해 구리 그리드를 배치합니다. 부드럽게 아래로 눌러 초과 접착제를 제거하십시오. 족집게 한 켤레로, 각 측면에 펄럭 아래 접착제의 작은 방울을 추가하고 슬릿 바로 아래쪽 포인팅되도록 블록의 앞면 위에 격자를 접으십시오. 그리드의 맨 위에는 블록과 수준에 있는지 확인하십시오. 완전히 건조하도록 허용합니다. </li><li> 전선 홀더 조립 : 하프 플라스틱 coverslip을 생략하고 &quot;U&quot;모양을 만들기 위해 중앙 조각을 제거합니다. &quot;U&quot;의 맨 위에 접착제 철사 한 조각으로 밀랍을 사용하여, 와이어가 너무 긴장하지 않습니다. </li><li> antennal 방어막을 구축 : 종이 구멍 펀치와 플라스틱 coverslip에 구멍을 확인하십시오. 0.5 X 0.7 cm로 coverslip의 가장자리를 트림. 접착제 후 피어싱 플라스틱 끈적끈적한 테이프로 coverslip하고 구멍을 통해 노출된 테이프에 대한 에탄올의 방울을 배치접착제를 제거합니다. </li></ol> 2. 동물 준비 <ol><li> 해당 유전자형의 파리 - 즉, &quot;드라이버&quot;와 활동 기자 transgenes의 원하는 조합을 베어링 - 1~3주 이전이어야합니다; 젊은 파리의 표피 컷이 너무 부드럽고 어렵습니다. 실험, 그리고 transgene 표현 수준을 일치하기 위해 여러 genotypes의 직접적인 비교가 필요하면, 파리는 연령과 관련된 생리적 차이를 피하기 위해 나이와 일치해야합니다. 성별은 중요하지 않다면, 우리는 그들이 더 큰 머리를 가지고 있고 조작하기 쉬운이기 때문에 여성의 파리를 사용하는 것을 선호합니다. </li><li> 얼음에 냉각에 의해 파리를 마취. </li><li> 마운팅 블록에 단일 플라이를 소개합니다. 날개 공동으로 파리를 잡고 밀어, 구리 격자의 슬릿을 따라 첫번째 지느러미 - 표면, 그것은 그것의 목 (그림 1B-C)에 의해 정지되어 있도록. 필요한 경우는 아래를 내려다 보면서 때까지 그것을 돌린다. </li><li> F 앞에서 훌륭한 선인장 척추를 놓으십시오(그림 1B-C) 이스케이프하지 않도록 요의 머리. 이동하지 않도록 코 앞에 선인장 척추를 놓습니다. 밀랍을 사용하여 블록 선인장 척추를 고정한다. 머리의 상단이 블록의 맨 위에있는 수준인지 확인합니다. </li><li> 로진의 작은 방울 (에탄올에 용해)로 블록 플라이의 머리를 고정한다. humidified 상자에 블록을 놓고 약 1 시간 단단해에 로진하실 수 있습니다. </li><li> 안테나와 머리 사이 cuticular 배 안에, 집게를 사용하여 홀더 (1.5 참조 왁스 - 사이드 아웃)에 와이어를 앞으로 antennal 접시를 뽑아 놓습니다. 밀랍으로 블록의 전면에 홀더를 고정한다. </li><li> 블록에 내장된 나사를 사용하여 부드럽게 antennal 판과 머리 사이 공간을 만들어야 앞으로 와이어 홀더를 밀어. </li><li> 중앙 위치에 구멍 파리의 머리의 맨 위에 antennal 실드를 (1.6 참조) 놓습니다. 장착 블록의 상단에 밀랍으로 수정합니다. </li><li> 블레이드 - 스플리터, 세제곱 사용방어막에 대한 테이프의 타 작은 구멍은 안테나 뒤에 파리의 머리 표피를 노출. 구멍가 새는에서 준비를 방지하기 위해 눈을 넘어 확대해서는 안됩니다. </li><li> 두 구성 요소 실리콘으로 테이프와 표피 사이에 구멍을 밀봉합니다. 파리의 머리 위로부터 초과 실리콘을 제거합니다. </li><li> 한 방울을 배치 Drosophila 울리는의 머리에 (130 MM NaCl, 5 KCl 밀리미터, 2 밀리미터 MgCl 2, 2 MM CaCl 2, 36 MM 이당류, 5 밀리미터 HEPES, 산도 7.3) 염분. 안테나 완전히 건조 남아 있어야합니다 전혀 누수가 없는지 확인합니다. 사파이어 블레이드를 사용하여 표피에 구멍을 했네요. 첫째, 가볍게 직접 안테나 뒤에 cuticular 배를 따라 점수는 다음 뒷면에 눈을 따라와 ocelli 전역 했네요. 마지막으로, 득점 끄트머리로 표피의 조각을 접어 antennal 신경을 severing 피하기 위해 아래쪽에서 했네요. </li><li> 조심스럽게 고급 핀셋으로 분비 및 호흡 관을 제거하십시오. Drosophila와 반복 린스 </em&gt;를 둘러싼의, 머리에 큰 방울을 떠난다. </li></ol> 3. 냄새 자극 배달 <ol><li> 악취 주사기가 : 총신 깊숙히 패드를 밀어 피펫 팁을 사용, 적절한 용매에 원하는대로 희석 분출 깨끗한 포셉 및 피펫 (필터 팁 사용) 악취의 20 μl로 2 ML 플라스틱 주사기로 셀룰로스 패드를 삽입 . 플러그 앤 캡 주사기가 필요 때까지. 적어도 3 개월 (혹은 더 자주 높은 휘발성 및 / 또는 자주 사용하는 악취의 경우) 신선한 냄새 dilutions도 미리 알고 있어야하고, 새로운 패드 단지 각각의 녹음 세션 전에 악취 주사기 준비되어야한다. 악취 농도가 가옥 수 있기 때문에보다 3 stimulations에 대한 악취 패드를 사용하지 마십시오. </li><li> 사용자 정의 만든 olfactometer (그림 2) : 주 공기 흐름은 (1 L / 분) 테플론 튜빙 (0.4 mm 내경)를 통해 이동되며 상류 이러한 튜브의 출구, 보조 공기 흐름 (1 L / 분 27cm ) 추가됩니다. 두 공기 흐름은 멤브레인 펌프에 의해 생성하고있다유속은 두 개의 독립적인 유량계에 의해 규제됩니다. 주의가 필요하다 (예 : ~ 60 분의 1 이상) 이상 - 가습을 피하기 위해 복용해야지만 에어 스트림, 가스 세척 병의 물을 통과하여 humidified 될 수 있습니다. 보조 공기 흐름은 악취 주사기 또는 빈 주사기를 통해서 이동됩니다 : 주사기는 플런저를 피어싱 주사기 바늘 (1.2 mm 외경)를 통해 공기 흐름으로 연결됩니다. 밸브 컨트롤러 장치 (예 : 하버드 기기 VC6)를 통해 제어되는 세 방향 마그네틱 밸브는 깨끗한 공기와 악취 자극 사이를 전환하는 데 사용됩니다. </li></ol> 4. 생체내 이미징에 <ol><li> 우리는 20x 수질 목표 (예 : 자이스 혈구 W &quot;플랜 - 고차 색지움&quot;20x / 1,0 M27 DIC) (그림 2)이 장착된 수직 형광 현미경 (예 : 똑바로 고정 무대 자이스 혈구 Axio 심사관의 D1)를 사용하여 여기에 이​​미징에 대해 설명합니다. G-CAMP (여기 / 방출 : 509분의 488 nm의)와 영상 내용 : 450-490 나노미터 여기 필터, 다음과 같은 특성을 가진 필터 블록을 사용, 이색성 거울 (T495LP) 및 500-550 nm의 방사 필터 (채도 동부 표준시). 현미경 플라이를 포함하는 마운팅 블록을 배치합니다. 파리의 안테나 앞 olfactometer 약 0.5 cm의 출구를 둡니다. </li><li> 그것은 파리의 머리에 울리는의 솔루션을 감동까지 목적을 낮춥니다. 머리 캡슐의 구멍은 중심과 국경 초점에되도록 밝은 - 그라운드 조명 하에서, 위치 준비를 뷰어를 통해 찾고. 당신이 표시된 뉴런을 (G-CAMP의 기저 녹색 형광의 명백한)을 볼 수까지 형광등으로 전환하고 초점을 조정합니다. </li><li> 전하 결합 장치와 이미지를 인수하여 관심 glomeruli에 파인 초점 (CCD) 카메라 (예 : CoolSNAP-HQ2 디지털 카메라 시스템) 적절한 수집 소프트웨어 (예 : Metafluor) (그림 3A)를 사용하는 현미경에 장착. 몇 군데 지역에 여기 광을 제한하기 위해 조명 광 경로에 격막을 닫습니다. </li><li> 냄새 evoked 녹음활동 4 Hz에서로 획득 률을 설정하고 CCD 카메라의 동적 범위 내에서 형광 값을 얻을 노출 시간을 조절하지만, 적어도 12 비트 다이나믹 해상도 1000 (임의 단위)보다 낮은 않습니다. 노출 시간은 G-캠프 photobleaching을 줄이기 위해 가능하면, 100 MS를 초과해서는 안됩니다. 카메라의 공간적 해상도가 허용하는 경우에는 노출 시간을 줄이기 위해 (한 디지털 픽셀로 binned됩니다 칩 우물의 수) binning을 높일 수 있습니다. 우리는 준비에서 210x135 μm의에 해당하는 350x225 픽셀 (2x2의 binning과)의 이미지를 구하십시오. 이러한 설정은 표백 기자를 제한하면서 좋은 공간과 시간적 해상도로 G-CAMP의 사구체 악취 유발 응답을 캡처할 최적입니다. </li><li> 측정 매개 변수를 설정합니다. 우리는 일반적으로 악취 자극 일반적으로 인수 기간의 시작 후에 사초를 시작 (프레임 15) 지속적인 일초 (U로, 10 초 (즉, 40 프레임)에 대한 기록ntil 프레임 19). 플라이 준비는 보통 흔히 photobleaching으로 인해 기자의 형광 신호에 돌이킬 수 감소에 의해 제한 25-30 다른 악취 자극에 함께 테스트할 수 있습니다. 상호 자극 간격은 관찰 응답의 강도와 photobleaching의 속도에 따라 달라집니다. 감각 적응을 피하기 위해 상호 자극 간격의 적절한 길이를 시범 실험에서 긍정적인 제어 냄새 (알려진 경우)의 반복적인 프레 젠 테이션에 의해 약 확인할 수 있습니다. 이 냄새의 포함은 주어진 일련의 모든 ~ 10 자극의 지속적인 생존 능력과 준비의 일관된 반응의 확인을 허용할 수 있습니다. </li></ol> 5. 데이터 처리 및 분석 데이터는 ImageJ (맥 biophotonics 플러그인과 함께 사용하여 처리 <a href="http://www.macbiophotonics.ca/">www.macbiophotonics.ca</a> )와 다음과 같이 Matlab 및 R에서 사용자 지정 작성된 프로그램 : <ol><li> 샘플 운동 구조물에 정정 :StackReg / TurboReg의 &quot;단단한 몸&quot;모드 (사용하는 늑대가 준비 (예 : 40 프레임 각각의 30 측정)에 해당하는 모든 이미지 정렬 <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg">bigwww.epfl.ch / thevenaz / stackreg</a> ImageJ에이). 이 단계는 측정 이내 사이의 인수 프레임에 관하여 레이블 뉴런의 위치에 변화를 제거하는 데 필요합니다. 그러나, XY 평면의 변화을 없애야 가능합니다. 초점의 강력한 변화가 발생할 경우 데이터는 폐기되어야합니다. </li><li> 개별 (40 프레임) 10 초 측정에 세그먼트 스택을. </li><li> 유물 표백을위한 올바른 : 형광등 불빛에 노출은 하나의 측정 10시 가옥하는 형광하게됩니다. 어떤 경우에는 그것은 데이터를 분석하기 전에이 부패에 대한 정정하는 것이 중요합니다. 각 측정 배경 프레임을 계산합니다. 이것은 자극 증상 (예 : 프레임 6-14) 이전에 여러 프레임의 평균 있어야합니다. 이 backg하여 각 프레임 나누기상대 형광 변화를 얻기 위해 프레임을 높이 들어라. G-CAMP에 의해 표시된 영역 내의 모든 픽셀을 평균하여 각 프레임에 대한 평균 상대 형광 값을 계산합니다. 악취 응답 (20 프레임의 경우 자극 증상 이후)의 시간 부양과 제로 체중 전에 프레임에 강한 무게를 준다 평균 형광 커브에 두 지수를 장착. 각 픽셀의 상대 형광 곡선에서 장착되어 커브를 뺍니다. 원시 데이터를 다시 얻을 배경 프레임에 의해 수정된 프레임을 곱하면됩니다. 신호 측정의 끝 (억제 또는 아주 강한 흥분성의 응답 evoked하는 경우 예) (그림 4)에 의해 기준에 반환하지 않는 경우 정정의 이러한 종류의 응답 역학의 변형을 초래할 수 있습니다. 표백 유물의 수정이 많은 경우에 유용하지만 표백 정정이 적용되는 경우, 시간적 매개 변수의 해석은주의하여야한다. </li><li> 형광의 상대적인 변화를 (&amp; 드 계산lta, F / F) (각 측정의 각 프레임에 대한 F, I, F 0) / F F 0의 I 번째 프레임에 대한 나도 형광 값 배경 프레임 (5.3 참조), 그리고 F는 0 * 100, 측정. </li><li> 활동 흔적 (그림 5A)을 구하는 10 개의 픽셀의 직경 glomerulus (그림 3B)에 대한 관심의 원형 지역 내의 평균 ΔF / F를 계산합니다. 원하는 경우 ImageJ를 (그림 5A)를 사용 heatmaps로 이들 성분을 변형. </li><li> 응답의 피크시 평균 ΔF / 네 프레임의 F에서 자극 전 평균 ΔF / 네 프레임 F를 빼는 방법으로 응답의 피크 진폭을 계산합니다. 동일한 절차는 공간적 응답 패턴을 (그림 3B 참조) 설명하고 (그림 5B 참조) 파리 전역의 관​​심을 특정 지역에서 응답 진폭을 계량하는 데 모두 사용됩니다. 피크 응답도 자극 시간, 또는 averagin 동안 곡선 아래의 영역을 통합하여 계량하실 수 있습니다응답의 최대 주변 G는 프레임. </li></ol> 6. 대표 결과 우리는 OSNs 29,30 여러 가지 인구 (년 활성 후각 공동 수용체 IR8a을 위해 발기인의 통제하에 G-CaMP1.6 28 표현 파리 프로피 온산-evoked 응답을 기록하고 분석할 위의 프로토콜을 사용 피규어 3-5). 1퍼센트 프로피 온산과 자극은 G-캠프 형광의 증가를 elicits - 세포 내 칼슘의 증가를 나타내는 - 두 glomeruli, DC4 및 DP1l (그림 3B)를 innervating OSNs에. 온라인 활동을 추적, heatmaps 및 피크 반응 바 줄거리 : 우리는 그림 5에서 여러 파리에서 데이터를 표현하는 다양한 방법을 설명합니다. 프로피 온산-evoked 응답 DC4와 DP1l의 뚜렷한 피크 amplitudes와 현세의 역학 있습니다. 반응은 일반적으로 강력한 있지만 또한, 개별 동물 사이의 다양성도 (자신을 볼 glomeruli 모두에서 볼 수 있습니다그림 5A에서 atmaps). 정상 반응 (그림 5B)의 부량은 동물 전반에 걸쳐 다양한 glomeruli하고 다른 odorants 간의 간단한 통계적 비교를하실 수 있습니다. 그러나, 냄새 evoked 칼슘 반응은 비 균일 현세의 역학을 가질 수 있으며 하나의 값으로 자신의 진도를 quantifying하면이 복잡성을 무시합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig1.jpg" /> 그림 1. 마운팅 블록의 도식 파리의 도입, 그리고 클로즈업의 (C) 상단보기 (31에서 적응) () 이전 (B) 후. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig2.jpg" /> 그림 2. 실험 설정의 도식. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig3.jpg" /> 그림 3. 단계 2.8 (왼쪽 패널)와 앤티의 원료 형광 이미지 후에 플라이 준비 () 톱보기nnal 엽 (叶)은 G-CaMP1.6 (; : G-CaMP1.6 : IR8a업자 UAS GAL4 유전자형)으로 표시. DC4와 DP1l glomeruli는 각각 그들의 형태, 크기와 위치에 의해 구분할 수 있으며, 빨간색과 파란색으로 표시됩니다. 프로피 온산 (1 % V / V)에 대한 응답의 (B) 색상 코딩된 이미지입니다. 이미지는 (또한 그림 5A 참조) 단계 5.6에 설명된대로 계산 응답의 피크의 ΔF / F에 해당합니다. 왼쪽 colorscale는 %의 ΔF / F 값을 나타냅니다. 검은 동그라미는 (그림 5 참조) 응답을 계량하는 데 관심있는 지역의 위치와 크기를 나타냅니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig4.jpg" /> 그림 4. 형광 기자 신호의 표백 수정. 5.3 단계에서 설명한대로 표백제 보정의 효과의 예. 왼쪽 패널에있는 샘플 데이터는 응답의 형태의 주요 변경없이 수정하실 수 있습니다. 오른쪽 패널에있는 샘플 데이터는 심각하게 영향을 미치지 않습니다가능성 표백제 보정에 의한 에드 신호가 떨어지고 냄새 자극 종료 후 기준 이하로 유지되기 때문입니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig5.jpg" /> 그림 5 (A) 탑 :. glomeruli DC4 (왼쪽)와 DP1l (오른쪽) 프로피 온산 (1 % V / V)에의 칼슘 반응의 시간적 역학. 검은 흔적은 8 동물에 걸쳐 관심 영역 (그림 3B 참조) 내에서 평균 ΔF / F의 평균을 보여줍니다. 회색 표면은 배포판의 첫번째와 세번째 quartiles 사이의 범위를 나타냅니다. 중앙 분리대 및 quartile 가치 프레 젠 테이션은 평균과 표준 에러보다 다양성과 관찰된 응답의 분포에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 녹색과 마젠타 박스는 프레임이 그림 3B에 표시하고, 그림 5B 논리적으로 양이 정상 응답을 계산하기 위해 평균 나타냅니다. 하단 : heatmaps은 ΔF / F 값을 repr과 함께 별도의 행에있는 모든 개별 동물에 대한 응답 데이터를 표시colorscale (맨 오른쪽)에 의해 esented. 수평 검은 막대가 자극의 시간과 기간을 나타냅니다. (B) DC4와 DP1l glomeruli위한 8 개의 동물에 걸쳐 프로피 온산에 언 피크 반응. 오차 막대는 배포판의 첫번째와 세번째 quartiles 사이의 범위를 나타냅니다.

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B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain.">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112, 271-282 (2003).</li><li>Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+expressed+cameleon+in+Drosophila+melanogaster+is+used+to+visualize+olfactory+information+in+projection+neurons.">Genetically expressed cameleon in Drosophila melanogaster is used to visualize olfactory information in projection neurons.</a> Curr. Biol. 12, 1877-1884 (2002).</li><li>Ng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+olfactory+information+between+three+populations+of+neurons+in+the+antennal+lobe+of+the+fly.">Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly.</a> Neuron. 36, 463-474 (2002).</li><li>Sachse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+plasticity+in+an+olfactory+circuit.">Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit.</a> Neuron. 56, 838-850 (2007).</li><li>Pelz, D., Roeske, T., Syed, Z., de Bruyne, M., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+receptive+range+of+an+olfactory+receptor+in+vivo+&#40;Drosophila+melanogaster+Or22a&#41;.">The molecular receptive range of an olfactory receptor in vivo &#40;Drosophila melanogaster Or22a&#41;.</a> J. Neurobiol. 66, 1544-1563 (2006).</li><li>Silbering, A. F., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+odor+mixtures+in+the+Drosophila+antennal+lobe+reveals+both+global+inhibition+and+glomerulus-specific+interactions.">Processing of odor mixtures in the Drosophila antennal lobe reveals both global inhibition and glomerulus-specific interactions.</a> J. Neurosci. 27, 11966-11977 (2007).</li><li>Reiff, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies.">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li><li>Abuin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+olfactory+ionotropic+glutamate+receptors.">Functional architecture of olfactory ionotropic glutamate receptors.</a> Neuron. 69, 44-60 (2011).</li><li>Benton, R., Vannice, K. S., Gomez-Diaz, C., Vosshall, L. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Brain+Imaging:+Fluorescence+or+Bioluminescence,+Which+to+Choose?.">In Vivo Brain Imaging: Fluorescence or Bioluminescence, Which to Choose?.</a> Journal of Neurogenetics. , 1-23 (2008).</li><li>Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+a+genetically+encoded+optical+sensor+of+neural+activity+using+electrophysiology+in+intact+adult+fruit+flies.">Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies.</a> Front. Neural Circuits. 1, 3-3 (2007).</li><li>Pfeiffer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9715-9720 (2008).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

여기에 설명된 준비와 분석 방법은 해당 드라이버 transgene 사용할 수있는 antennal 엽 (OSNs, 종이 및 PNs)에서 뉴런의 인구 냄새 evoked 응답을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 형광 현미경을 사용하여 응용 프로그램을 설명하는 동안,이 준비 광학 이미징은 동일 공촛점 또는 두 개의 광자 현미경 22,32을 사용하여 수행할 수 있습니다. 사실, 이러한 후자의 악기 뉴런 Express의 특히 많은 수의 기자, 이미지의 해상도를 줄일 수 있습니다 와이드 필드 현미경의 광 산란 문제를 완화. 이러한 준비는 보통 50 이상의 시간 동안 냄새 evoked 응답 녹음을 허용하지만, 이번 기록 측정의 수와 길이에 따라 크게 길거나 짧게 될 수 노출 시간은 각 프레임과 상호 자극 간격에 사용. 또한, 두 광자 여기는 형광 기라으로 photobleaching 줄일 수 있습니다orter뿐 아니라 세포 phototoxicity는 긴 시간대 22,32 걸쳐 측정을 허용합니다. 에 관계없이 현미경의 선택, 헤드 캡슐 내에 파리 두뇌의 움직임이 가장 회귀 문제가있을 때 그대로 동​​물의 이미지. 움직임 보정이 사소한 문제 (단계 5.1) 수정할 수 있지만, 그것은 일반적으로 더에만 매우 안정 대책에서 레코드입니다. 운동 유물을 줄이기위한 전략은 다음과 같습니다 :은 (i) 제대로 선인장 척추와 플라이의 코를 constraining, (ii) 본 eicosane (사전 2.6 단계) (eicosane는에서 용해 수와 함께 무대로 고정하여 파리의 다리를 immobilizing ~ 37 ° C는,이 목적을 위해 납땜 인두)의 끝부분을 확장하고 수정 실버 와이어를 사용하지 않습니다 (3) 고급 핀셋으로 식도를 (antennal 신경 사이에 보이는) nicking. 여기에 사용된 G-CaMP1.6 외에도 G-CAMP 및 기타 칼슘 지표의 최적화된 버전의 숫자가 가능합니다그들의 신호 대 노이즈 비율, 기본적인 형광과 측두엽 역학 12,28,33에있는 다릅니다. 센서의 정확한 선택은 계정에 이러한 속성의 모든 뉴런의 유형이 분석되어야하고, 생물 학적 문제가 해결되는 정도 소요됩니다. 전류 센서는 그대로 파리의 신경 활동과 광학 이미징의 잠재력을 향상시키기 위해 지속적으로 특정 유전 드라이버 라인을 35 증가와 결합 행동 잠재력 12,34, 그들의 추가적인 개선과 함께 꽤 ​​잘 상관 관계 칼슘 변경을보고합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 공급 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 선인장 척추 </td><td> 가든 센터 </td><td></td><td> 너무 유연하지 ~ 7mm 긴 얇은 </td></tr><tr><td> 로진 </td><td> 문자열 악기 상점 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 두 구성 요소 실리콘 </td><td> WPI </td><td> KWIK-SIL </td><td></td></tr><tr><td> 사용자는 플렉시 글라스 장착 블록을 만들 </td><td> 에서 제공하는 청사진 <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 구리 격자 </td><td> 아테나 격자 </td><td> G220-5 </td><td> 일반적으로 전자 현미경 표본을 위해 사용됩니다. </td></tr><tr><td> 나사 </td><td> 철물점 </TD&gt; <td></td><td> 2mm 직경 </td></tr><tr><td> 플라스틱 coverslips </td><td> 렌즈가 종 </td><td> L4193 </td><td> 22 X 22mm </td></tr><tr><td> 납땜 인두 팁 </td><td> 콘라드 전자 </td><td> 830283-62 </td><td></td></tr><tr><td> 규제 전원 공급 장치 </td><td> 콘라드 전자 </td><td> 511407-62 </td><td></td></tr><tr><td> 얇은 철사 </td><td> Isabellenhütte </td><td> ISA-옴 </td><td> 0.013 mm </td></tr><tr><td> Eicosane </td><td> 시그마 </td><td> 21,927-4 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 </td><td> 자이스 혈구 </td><td> Axioexaminer의 D1 </td><td></td></tr><tr><td> CCD 카메라 </td><td> Visitron </td><td> CoolSnap HQ </td><td></td></tr><tr><td> Metafluor </td><td> Visitron </td><td></td><td> 수집 소프트웨어 </td></tr><tr><td> 단색 화 </td><td> Visitron </td><td> Visichrome </td&gt; <td></td></tr><tr><td> 깨뜨릴 수있는 블레이드 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 10050-00 </td><td></td></tr><tr><td> 블레이드를위한 홀더 </td><td> WPI </td><td> 14,134 </td><td></td></tr><tr><td> 사파이어 블레이드 </td><td> WPI </td><td> 500,314 </td><td> 더블 블레이드 1mm를 깨끗 </td></tr><tr><td> 멤브레인 가스 펌프 </td><td> KNF Neuberger AG </td><td> NMP 830 KVE </td><td></td></tr><tr><td> 사파이어 블레이드 홀더 </td><td> WPI </td><td> 500,317 </td><td></td></tr><tr><td> 세 방향 밸브 </td><td> 리 회사 </td><td> LFAA1200118H </td><td> 구성 E </td></tr><tr><td> Rotameter 500 ML / 분 </td><td> Analyt-MTC </td><td> 112-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Rotameter 5 L / 분 </td><td> Analyt-MTC </td><td> 102-08SA </td><td></td></tr><tr><td> 밀랍 </td><td> Siladent Technik </td><td> 209,212 </td><td>; </td></tr><tr><td> 셀룰로스 패드 </td><td> Kettenbach 의료 </td><td> 31,003 </td><td></td></tr><tr><td> 족집게 </td><td> 렌즈가 종 </td><td> T5130 </td><td> 뒤몽 생물학 # 5 </td></tr><tr><td> 주사기 </td><td> BD </td><td> 300,928 </td><td> 2ml, Discardit II, 2pieces </td></tr><tr><td> 니들 </td><td> 브라운 Sterican </td><td> 4,665,120 </td><td> 1.2mm OD </td></tr></tbody></table>

calcium imaging of odor-evoked responses in the drosophila antennal lobe

antennal 기억 상실증이 곤충 두뇌의 기본 후각 중심, 척추 후각 망울 1-5의 해부 학적 및 기능적 동등을 나타냅니다. 외부 세계에서 후각 정보는 그들이 표현하는 구체적인 후각 수용체에 따라 glomeruli라는 neuropil의 독특한 지역으로 분리 후각 감각 뉴런 (OSNs)에 의해 antennal 엽 전달된다. 여기, 누구의 프로세스 모두 현지 interneurons있는 OSN axons 시냅스 (LNs)는 높은 후각 뇌 영역 후각 정보를 전달하는 다양한 glomeruli 및 프로젝션 뉴런 (PNs)를 신경을 분포시키다하실 수 있습니다. antennal 엽의 OSNs, LNs 및 PNs의 활동의 광학 이미징 - 전통적으로 합성 칼슘 지표 (예 : 칼슘 녹색, FURA-2) 또는 전압에 민감한 염료 (예 : RH414)를 사용 - 긴 이해하는 중요한 테크닉에게 얼마나 후각 자극은 공간과 시간적 패턴으로 표현됩니다곤충 6-10 여러 종류의 사구체 활동. 이러한 형광 칼슘 지표 G-CAMP 11,12 및 Cameleon 13, 발광 생물 칼슘 표시기 GFP-aequorin 14,15, 또는 시냅스 전송 리포터 유전자로 인코딩된 신경 활동 기자의 개발, synapto-pHluorin 16을 이루었습니다 fruitfly의 후각 시스템 neurophysiological 이미징 특히 접근 Drosophila melanogaster는 자사의 종합적-설명한 분자 electrophysiological 및 neuroanatomical 속성 2,4,17을 보완. 이 기자는 선택적으로 악취-evoked 얼마나 높은 공간과 시간적 해상도로 해부하는 후각 회로 내의 뉴런의 정의 인구의 이진 transcriptional 제어 시스템 (예 : GAL4/UAS 18 LexA / LexAop 19,20, Q 시스템 21)를 통해 표현할 수 신경 활동은 대표 변조 및 22-24로 변화하고 있습니다 &lt;/&gt;이 저녁을 먹다. 여기에서 우리는 G-CAMP 25-27을 사용 Drosophila antennal 엽에서 냄새 evoked 응답을 측정하기 위하여 준비 및 분석 방법을 설명합니다. 동물의 준비는 최소한 침략적이며 넓은 필드 형광 공촛점과 두 광자 현미경을 사용하여 이미지에 적용할 수 있습니다.

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Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

우리는 생활 antennal 엽에서 냄새 evoked 칼슘 반응을 측정하고 분석하기 위해 설립 기법을 설명<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

의 냄새-evoked 응답의 칼슘 이미징 Drosophila Antennal 엽

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

calcium-imaging-odor-evoked-responses-drosophila-antennal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

25.8K 조회수.  University of Lausanne. 우리는 생활 antennal 엽에서 냄새 evoked 칼슘 반응을 측정하고 분석하기 위해 설립 기법을 설명 Drosophila melanogaster.

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Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

광 반사율과 Autofluorescence 신호를 사용하여 마우스 후각 망울에서 이미징 냄새 Evoked 활동

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

연구

신경과학

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

영상의 연결 응답 Vomeronasal 조직의 슬라이스 준비에 유전적으로 인코딩된 칼슘 센서를 표현

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Hypothalamic 마우스 뇌 슬라이스의 GFP 태그 뉴런의 영상 칼슘 응답

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe

All organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is especially important in insects, which use their olfactory systems to respond to, and discriminate amongst, complex odor stimuli. These odors elicit behaviors that mediate processes such as reproduction and habitat selection1-3. Additionally, chemical sensing by insects mediates behaviors that are highly significant for agriculture and human health, including pollination4-6, herbivory of food crops7, and transmission of disease8,9. Identification of olfactory signals and their role in insect behavior is thus important for understanding both ecological processes and human food resources and well-being.
	To date, the identification of volatiles that drive insect behavior has been difficult and often tedious. Current techniques include gas chromatography-coupled electroantennogram recording (GC-EAG), and gas chromatography-coupled single sensillum recordings (GC-SSR)10-12. These techniques proved to be vital in the identification of bioactive compounds. We have developed a method that uses gas chromatography coupled to multi-channel electrophysiological recordings (termed 'GCMR') from neurons in the antennal lobe (AL; the insect's primary olfactory center)13,14. This state-of-the-art technique allows us to probe how odor information is represented in the insect brain. Moreover, because neural responses to odors at this level of olfactory processing are highly sensitive owing to the degree of convergence of the antenna's receptor neurons into AL neurons, AL recordings will allow the detection of active constituents of natural odors efficiently and with high sensitivity. Here we describe GCMR and give an example of its use.
	Several general steps are involved in the detection of bioactive volatiles and insect response. Volatiles first need to be collected from sources of interest (in this example we use flowers from the genus Mimulus (Phyrmaceae)) and characterized as needed using standard GC-MS techniques14-16. Insects are prepared for study using minimal dissection, after which a recording electrode is inserted into the antennal lobe and multi-channel neural recording begins. Post-processing of the neural data then reveals which particular odorants cause significant neural responses by the insect nervous system.
	Although the example we present here is specific to pollination studies, GCMR can be expanded to a wide range of study organisms and volatile sources. For instance, this method can be used in the identification of odorants attracting or repelling vector insects and crop pests. Moreover, GCMR can also be used to identify attractants for beneficial insects, such as pollinators. The technique may be expanded to non-insect subjects as well.

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings GCMR in the Insect Antennal Lobe

Olfactory cues mediate many different behaviors in insects, and are often complex mixtures comprised of tens to hundreds of volatile compounds. Using gas chromatography with multi-channel recording in the insect antennal lobe, we describe a method for the identification of bioactive compounds.

곤충 Antennal 엽에 가스 크로마토 그래피 - 멀티 유닛 레코딩 (GCMR)를 사용하여 강한 휘발성 물질의 식별

All  organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their  behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

초파리 멜라노가스터에서 학습 유발 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte function is not fully known. Pericytes have been suggested to be involved in capillary development, regulation of endothelial barrier tightness and trancytosis activity, regulation of capillary tone and to play crucial roles in certain brain pathologies.
Pericytes are challenging to investigate in the intact brain due to the difficulties in visualizing processes in the brain parenchyma, as well as the close proximity to the other cells of the NVU. The present protocol describes a method for isolation and culture of primary bovine brain capillary pericytes and their following usage in calcium imaging studies, where effects of agonists involved in brain signaling and pathologies can be investigated. Cortical capillary fragments are allowed to attach to the bottom of culture flasks and, after 6 days, endothelial cells and pericytes have grown out from the capillary fragments. The endothelial cells are removed by gentle trypsinization and pericytes are cultured for 5 additional days before passaging.
Isolated pericytes are seeded in 96-well culture plates and loaded with the calcium indicator dye (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) to allow for measurements of intracellular calcium levels in a plate reader setup. Alternatively, pericytes are seeded on coverslips and mounted in cell chambers. Following loading with the calcium indicator (Cal-520 AM), calcium live-imaging can be performed using confocal microscopy at an excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 510-520 nm.
The method described here has been used to obtain the first intracellular calcium measurements from primary brain capillary pericytes, demonstrating that pericytes are stimulated via ATP and are able to contract in vitro.

Brain capillary pericytes are essential players in the regulation of blood-brain barrier properties and blood flow. This protocol describes how brain capillary pericytes can be isolated, cultured, characterized with respect to cell type and applied for investigations of intracellular calcium signaling with fluorescent probes.

세포칼슘 측정 및 칼슘 이미징 연구를 위한 뇌 모세관 과구 배양

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using calcium as a proxy for neuronal activity, these techniques provide a way to monitor the responses of individual cells within large neuronal ensembles to a variety of stimuli in real time. We, and others, have applied these techniques to image the responses of individual geniculate ganglion neurons to taste stimuli applied to the tongues of live anesthetized mice. The geniculate ganglion is comprised of the cell bodies of gustatory neurons innervating the anterior tongue and palate as well as some somatosensory neurons innervating the pinna of the ear. Imaging the taste-evoked responses of individual geniculate ganglion neurons with GCaMP has provided important information about the tuning profiles of these neurons in wild-type mice as well as a way to detect peripheral taste miswiring phenotypes in genetically manipulated mice. Here we demonstrate the surgical procedure to expose the geniculate ganglion, GCaMP fluorescence image acquisition, initial steps for data analysis, and troubleshooting. This technique can be used with transgenically encoded GCaMP, or with AAV-mediated GCaMP expression, and can be modified to image particular genetic subsets of interest (i.e., Cre-mediated GCaMP expression). Overall, in vivo calcium imaging of geniculate ganglion neurons is a powerful technique for monitoring the activity of peripheral gustatory neurons and provides complementary information to more traditional whole-nerve chorda tympani recordings or taste behavior assays.

Here we present how to expose the geniculate ganglion of a live, anesthetized laboratory mouse and how to use calcium imaging to measure the responses of ensembles of these neurons to taste stimuli, allowing for multiple trials with different stimulants. This allows for in depth comparisons of which neurons respond to which tastants.

마우스 의 생체 칼슘 이미징에서 맛 자극에 신경절 신경 반응

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

망막 신경절 세포층에서의 칼슘 활성 평가

Calcium Imaging In Electrically Stimulated Flat-Mounted Retinas

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the impaired light-sensing photoreceptor cells in the degenerated retina, aiming to partially restore vision by inducing visual percepts. One common avenue of investigation involves the design and production of implantable devices with a flexible physical structure, housing a high number of electrodes. This enables the efficient and precise generation of visual percepts. However, with each technological advancement, there arises a need for a reliable and manageable ex vivo method to verify the functionality of the device before progressing to in vivo experiments, where factors beyond the device's performance come into play. This article presents a comprehensive protocol for studying calcium activity in the retinal ganglion cell layer (GCL) following electrical stimulation. Specifically, the following steps are outlined: (1) fluorescently labeling the rat retina using genetically encoded calcium indicators, (2) capturing the fluorescence signal using an inverted fluorescence microscope while applying distinct patterns of electrical stimulation, and (3) extracting and analyzing the calcium traces from individual cells within the GCL. By following this procedure, researchers can efficiently test new stimulation protocols prior to conducting in vivo experiments.

저자 스포트라이트: 칼슘 이미징을 사용한 신경 전기 자극에 대한 혁신적인 접근 방식 

Retinal prostheses have the ability to generate visual perceptions. To advance the development of new prostheses, ex vivo methods are needed to test devices before implantation. This article provides a comprehensive protocol for studying calcium activity in the retinal ganglion cell layer when subjected to electrical stimulation.

전기적으로 자극된 평판 장착 망막의 칼슘 이미징

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the ...