정수리 상피 세포의 활성화는 신장의 구체에 있는 흉터 조직의 발달에 있는 중요한 요인에 있습니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 이 활성화에 관련되었던 세포 프로세스를 공부하고 잘하면 질병 진행을 늦추거나 조차 중단하는 처리 선택권을 찾아볼 수 있습니다. 우리의 기술의 주요 장점은 우리가 고립 된 사구에서 바로 성장하는 1 차 세포를 사용하는 것입니다.
신장을 해방 한 후, 텍스트 원고에 설명 된 바와 같이, 수술 집게와 신장을 잡고 신장 캡슐을 당겨 집게의 또 다른 쌍을 사용합니다. 그 후, 각각 HBSS의 두 밀리리터를 포함하는 여섯 개의 잘 문화 판의 우물에 신장을 배치하고 얼음에 문화 판을 배치합니다. 첫째, 신장을 100mm 페트리 접시로 옮기고 두 개의 메스를 사용하여 약 1~ 2밀리미터의 작은 조각으로 다진다.
다진 신장 조각을 HBSS로 젖게 하십시오. 다음으로, 신장 조각을 300 마이크로미터 금속 체 위에 놓고 20 밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 체를 통해 신장을 누릅니다. 반복적으로 사이에 HBSS로 체를 헹이고 흐름을 수집하고 깨끗한 페트리 접시로 전송하는 세로지학적 파이펫을 사용합니다.
메스를 사용하여 체 바닥에 남아있는 모든 것을 긁어 수집 된 신장 균질로 옮긴다. HBSS로 75 및 53 마이크로미터 체로 신장 균모를 헹구는 다. 그런 다음 두 체를 HBSS로 세척하여 모든 작은 구조를 제거합니다.
20%의 태아 종아리 혈청을 보충한 DMEM으로 각각의 상부 표면을 세척하여 체에 남아 있는 신장 구조와 물질을 수집하고 6개의 매우 낮은 부착 마이크로플레이트의 우물로 재료를 옮기시다. 초저 부착 마이크로플레이트를 거꾸로 된 빛 현미경으로 가져와서 캡슐화되거나 캡슐화된 글로메룰리를 수집한 20 마이크로리터 파이펫을 사용하십시오. 파이펫 팁에 단일 구체를 잡은 후, 20 마이크로 리터의 부피에 동일한 파이펫 팁에 수집 된 신장 물질없이 신선한 DMEM 배지를 추가합니다.
DMEM 배지를 가진 단일 구엽물을 24개의 잘 된 세포 배양 판의 중심으로 옮기고 3시간 동안 5%의 이산화탄소로 37도에서 배양하여 음의 중심에 구생물을 부착할 수 있도록 한다. 인큐베이션 후, 사구체는 우물의 중앙에 부착됩니다. 신중하게 추가 500 내피 성 기초 매체의 마이크로 리터 성장 인자 키트와 추가 5% FBS와 1% 페니실린과 연쇄 절제술각 각 우물에 보충.
6일 동안 이산화탄소5%를 기록하며 섭씨 37도에서 단일 구사체를 배양합니다. 6일 간의 배양 후 디지털 반전 광 현미경을 사용하여 이미지를 찍고 구체 배기 성장을 분석합니다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 배율 막대가 있는 이미지 파일 중 하나를 열어 구사물 확장의 표면적을 결정합니다.
축척 막대에 직선을 그리고 분석(Analyze)을 클릭한 다음 측정하여 픽셀의 거리를 결정합니다. 축척을 확인하려면 확장성 분석 및 설정을 클릭하고 알려진 거리 픽셀, 알려진 거리 및 길이 단위의 입력을 클릭합니다. 완료되면 확인을 클릭합니다.
측정 분석 및 설정을 클릭합니다. 그런 다음 영역 및 표시 레이블에 대한 옵션을 확인합니다. 완료되면 확인을 클릭합니다.
다음으로, 구체 아웃스주위에 프리핸드 셀렉션을 그립니다. 분석 및 측정을 클릭하여 이전 결정된 축척에서 아웃성장의 표면적을 포함하는 결과 테이블을 표시합니다. 이 연구에서는 캡슐화된 사구체 세포의 구체 상피 세포 가 생후로 마우스 신장으로부터 분리되고 배양되고 분석됩니다.
대표적인 광 현미경 이미지는 사구체가 마우스 신장으로부터 분리된 후 배양 중 다른 시점에서 사구체 의 성장을 보여준다. 확장되는 세포가 정수리 상피 세포임을 확인하기 위해, 탈캡슐화된 구엽기는 6일 동안 격리되고 배양된다. 탈캡슐화된 사구는 이 잠복기 동안 세포 밖으로 성장을 나타내지 않습니다.
면역형성 염색은 상이한 정수리 상피 세포 마커, 사진 부위 특이적 마커 및 내피 세포 마커를 위해 수행됩니다. 결과는 성장하는 세포가 실제로 정수리 상피 세포임을 확인합니다. CD44 녹아웃 마우스로부터 연관된 글로메룰리는 야생형 마우스로부터 분리된 사구체에 비해 구체 아웃성장의 표면적뿐만 아니라 성장하는 세포의 수가 감소하는 것을 나타낸다.
이것은 정수리 상피 세포 활성화에 있는 CD44를 위한 중요한 역할을 건의합니다. 이 기술을 사용 하 여, 그것은 또한 정 수리 상피 세포 활성화에 약물에 미치는 영향을 공부 하는 것이 가능. 이것은 당신의 선택의 약으로 고립된 glomeruli를 취급하고 세포 성장 및 세포 이동에 있는 다름을 분석하기 위하여 행해질 수 있습니다.
