The work was supported by grants from the Universit&#233; catholique de Louvain (Action de recherch&#233; concert&#233;es) and the Fund for Scientific Medical Research (F.R.S.-FNRS, Belgium). A.-S.D. is a doctoral fellow from T&#233;l&#233;vie, A.-C.H. held a fellowship from the Fonds pour la formation &#224; la Recherche dans l'Industrie et dans l'Agriculture (Belgium), M.V. is supported by the de Duve Institute and C.E.P. is a senior research associate of the F.R.S.-FNRS (Belgium).

마우스는 대학 동물 복지위원회의 실험실 동물 관리의 원칙에 따라 제기 및 처리 하였다. 모든 절차 및 프로토콜은이위원회에 의해 승인되었다. 1. 현미경 플라스틱 문화 챔버의 코팅 참고 : 층류 후드에서 무균 조건 하에서 다음의 모든 단계를 수행합니다. 코팅의 두 종류가 기능적으로 동일하다. <ol><li> 피브로넥틴 전에 갑상선 조직을 분리 한 하루 코트 플라스틱 문화 실 : <ol><li> 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 0.25 ㎍ / ㎖의의 fungizone 2 MM의 글루타민 (12)와 보충 M199 배지에서 50 ㎍ / ml의 최종 농도로 멸균 피브로넥틴을 희석. </li><li> 희석 피브로넥틴의 200 μL와 우물을 덮고 4 ° C의 냉장고에 하룻밤 배양한다. </li><li> 해부의 날, M1에 한 번 우물을 씻어, 피브로넥틴을 대기음99 및 항생제, 글루타민, 10 % 소 태아 혈청이 보충 된 M199 200 μL의 최소 부피를 추가한다. </li><li> 외식을 도금 할 준비가 될 때까지 인큐베이터에 코팅 된 실을 남겨주세요. </li></ol></li><li> 유형 코트 플라스틱 문화 챔버 나는 갑상선 조직을 분리하기 전에 2 시간 콜라겐 : <ol><li> 나는 10 mM의 염산에 50 ㎍ / ㎖의 최종 농도 콜라겐 멸균 유형을 희석. 참고 : 얼음 콜라겐 원액을 유지합니다. </li><li> I 콜라겐 희석 타입의 200 μL와 우물을 덮고 실온 (RT)에서 2 시간 동안 배양한다. </li><li> 내가 솔루션을 콜라겐 유형을 대기음, M199 한 번 우물을 씻어 항생제, 글루타민, 10 % 소 태아 혈청으로 보충 M199 200 μL의 최소 볼륨을 추가합니다. </li><li> 외식을 도금 할 준비가 될 때까지 인큐베이터에 코팅 된 실을 남겨주세요. </li></ol></li></ol> 갑상선 ANLAGEN 함유 조직의 2. 해부 (E12.5) 또는 갑상선 엽 (E13.5-E14.5) 참고 : 깨끗한 해부 도구와 페트리 / 문화 판을 사용합니다. 아래에서 설명하는 일반적인 단계와 절개 E12.5 및 E14.5 배아에 대해 동일합니다. <ol><li> 원하는 배아 (E12.5에서 E14.5에) (E) 일에 시간 초과 - 임신 여성 생쥐를 희생과 해부 도구를 사용하여 자궁을 제거합니다. </li><li> HBSS를 포함하는 10cm 접시에 해부 자궁을 놓습니다. </li><li> 집게로 자궁의 한 끝단을 잡고 점진적으로 모든 배아를 해방하는 작은 가위로 자궁을 엽니 다. </li><li> 가위로 태반에서 배아를 분리하고 HBSS를 포함하는 새로운 10cm 접시에 자신의 배외 (extraembryonic) 멤브레인 배아를 전송합니다. </li><li> 난황과 양막을 제거합니다. 참고 :이 시점에서, 아래에서 transillumination와 실체 현미경을 작동; 해부 단계 배율을 증가시킨다. 도구를 해부로 유리 모세관에있는 텅스텐 바늘을 사용합니다. </li><li> 같은 바늘을 사용나이프와 포크는, 위 턱과 귀 (따라 절단 그림 1A)를 포함하여, 머리의 윗부분을 제거합니다. </li><li> 그 뒷면에있는 배아를 잡고 먼저 신경 튜브의 추가 조각 (B 따라 절단 그림 1A), 배 (胚)의 후 하부, 단지 전방 사지에서와 마음 (그림 1B) 이상을 제거합니다. </li><li> HBSS를 포함하는 새로운 10cm 접시에 혀 (조직의 방향을)과 목 영역을 포함하는 배아 슬라이스를 전송합니다. </li><li> 신경 튜브를 제거하고 조직 (따라 절단 그림 1C) 식도 / 기관에 후부. </li><li> 부드럽게 섹션 (B와 B &#39;를 따라 잘라 그림 1C) 혀의 양측을 따라 조직 슬라이스. </li><li> 혀의 연장에서, 식도와 기관을 찾아 (그림 1D, 따라 절단), 그리고 로봇의 조직을 팽창 조각으로 부서져을 떠나, 혀를 멀리 해부(B와 B &#39;를 따라 잘라 그림 1D) 식도 / 기관 h의 측면. </li><li> 식도를 제거하고, 그 복부면이 위로 향하게하여 기관을 배치합니다. </li><li> 이러한 흉선 (그림 1E)와 인두 아치 동맥 옆으로있는 모든 조직과 원치 않는 조직을 멀리 해부하다. (그림 1 층, 빨간 점선) E13.5 또는 E14.5 배아의 경우, 기관의 양쪽에 갑상선 엽 (叶)을 시각화하고 또한 기관에서 엽 (叶)을 해부하다. </li><li> 항생제, 글루타민, 10 % 소 태아 혈청이 보충 된 예열 된 M199 배지를 함유하는 35mm 배양 접시에 절연 E12.5 기관지 영역 또는 E13.5-E14.5 갑상선 엽 전송. P-200 마이크로 피펫에 prewetted 필터 팁을 사용하여 외식을 전송합니다. E12.5 외식의 경우, 개방을 확대하는 팁의 사지를 잘라. 참고 : 배아가 동일한 유전자형이있는 경우 정기적으로하고, 모든 배아 단계 6 및 7을 수행,N 9-11, 그리고 마지막으로 12 &amp; 13. </li></ol> 갑상선 외식 3. 도금 및 문화 <ol><li> 예열 된 배지 1 ㎖를 함유하는 24 - 웰 플레이트의 웰에 세 연속 전송으로 이식편을 워시 (= M199 항생제, 글루타민, 10 % 소 태아 혈청이 보충 된). </li><li> 코팅 현미경 플라스틱 문화 실에 갑상선 엽 (叶)의 도금 : <ol><li> 코팅 챔버에서 대기음 M199 배지. </li><li> 조심스럽게, 마이크로 피펫 및 필터 팁을 사용하여 배양 챔버로 갑상선 외식을 전송합니다. 각 실의 중앙에 하나의 이식편을 놓습니다. </li><li> 초과 매체를 제거하고 조직 문화 인큐베이터에서 배양 챔버를 배치 (37 °의 C, 5 % CO 2) 2 시간 동안 외식 행렬에 부착 할 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 잘 각각 예열 문화 매체의 200-300 μl를 추가합니다. </li><li> 조직 문화 인큐베이터에서 장기 문화를 품다. </li></ol></li><li> 도금 Osemiporous 필터에 대한 F의 기관 영역 또는 갑상선 엽 (叶) : <ol><li> 예열 된 배지 330 μL에 필요한 24 - 웰 플레이트의 우물의 수를 입력합니다. </li><li> 문화 필터 아래 기포의 포획을 방지하기 위해주의하면서 중간에 자리 필터 (예를 들어, 0.4 μm의 밀리 포아 필터). </li><li> 조심스럽게, 마이크로 피펫 및 필터 팁을 사용하면, 필터의 중심 (최대 4/filter)에 매체의 최소한의 볼륨 갑상선 외식을 전송합니다. </li><li> 텅스텐 바늘로 외식 밖으로 매체와 공간의 초과를 제거합니다. </li><li> 조직 문화 인큐베이터에서 장기 문화를 품다. 참고 : 층류 후드에서 변경 배지 매일. 7 일까지 문화 외식. </li></ol></li></ol> 갑상선의 Explants 4. 전체 마운트 면역 형광 염색법 프로토콜 텅스텐 바늘을 사용하거나 (아래 2 단계 이후) 필터에 성장 외식을 제거미세 집게와 차 (5 단계), 제 2 (7 단계) 항체 배양 (96 - 웰 플레이트)을 제외한 모든 단계를위한 24 - 웰 플레이트에 전송. 현미경 플라스틱 실에서 배양 부착 외식의 경우, 문화 챔버의 모든 단계를 수행합니다. <ol><li> 기음 M199 배지와 20 분 (24 - 잘 접시에 500 μL와 현미경 슬라이드에 300 μL)를위한 얼음처럼 차가운 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)와 이식편을 고정합니다. </li><li> 트리톤과 트리스 완충 생리 식염수로 2 배 10 분 세척 (TBST, 50 mM 트리스 염산의 pH 7.5, 150 mM의 염화나트륨, 0.1 % 트리톤 X-100)를 RT에서. </li><li> -20 ℃에서 바로 외식 또는 저장 처리 주 : -20 ° C에서의 장기 저장을 위해, 서서히 100 % 메탄올에 도달하는 TBST에 메탄올 농도를 증가시킴으로써 메탄올 이식편 탈수. 준비가 면역 염색 (4 단계)를 계속하면 점차 메탄올 TBST를 추가하여 외식을 재수. </li><li> 차단 용액 (10 % TBST 정상 염소 혈청 TBST를 교체)와 실온에서 30 ~ 60 분 동안 바다를 보았다 로커에 품어. </li><li> (조건 당 100 ~ 200 μL)를 차단 솔루션 1 차 항체를 희석. 96 - 웰 플레이트에 24 - 웰 플레이트에서 &quot;필터&quot;외식을 전송합니다. 4 ℃에서 하룻밤 바다 톱 로커의 기본 항체 절편을 품어 </li><li> 다음 날, 차 항체 솔루션을 버리고 다시 24 웰 플레이트의 &quot;필터&quot;외식을 전송하고, 45 ~ 60 분 실온에서 각각 바다 톱 로커에 TBST로 5 배 이상 씻는다. </li><li> 정상 염소 혈청의 1 %가 포함 된 TBST에서 이차 항체 (1:2,000 희석 예를 들어, 염소 항 - X-알렉사 플 루어)를 희석하고 4 ° C에서와 어둠 속에서 바다를 보았다 로커에 하룻밤이 희석 외식을 배양한다. 핵 counterstaining를 들어, 함께 차 항체 솔루션 비스 - Benzimide (헥스) 1 ㎍ / ㎖의 (가) 있습니다. </li><li> 다음 날, 차 항체 솔루션을 버리고 바다 톱에 TBST로 배를 씻어45 ~ 60 분 실온에서 각각 로커. 세척하는 동안 어둠 속에서 외식을 유지합니다. </li><li> TBST 부드럽게 어둠 속에서 4 ° C에서 하룻밤 소용돌이에 추가 세척을 수행합니다. </li><li> 후위 10 분 동안 4 ° C에서 4 % PFA의 면역 염색 외식. </li><li> TBST로 2 배 10 분 씻으십시오. </li><li> -20 ° C에서 장기 저장을 위해 하나 점차 메탄올 100 %를 외식을 전송하거나 즉시 분석 할 수 있습니다. 필터에서 배양, 24 웰 플레이트에 면역 염색, 이전에 다 나 공 초점 현미경 분석 TBST 이상 형광등 설치 매체와 현미경 실 (예 : LabTek 또는 Ibidi)에 전송 외식하십시오. </li></ol> 갑상선에서 RNA의 5. 추출 RNase가없는 환경에서 작업 할 수 있습니다. 따라서, 핵산과 핵산 분해 효소 무료 피펫 팁을 사용하여 오염 물질과 RNases에서 벤치 및 장비를 모두 청소합니다. 페놀 / 클로로포름를 기반으로하기 때문에이 프로토콜은, 첫 번째 단계를 수행의 화학 후드 (1 ~ 7). <ol><li> 1.5 ML 튜브에 일회용 유를 사용하여 RNA 추출 용액 300 μL로 한 갑상선 이식편 또는 두 개의 갑상선 엽 (叶)을 균질화. 의 샘플 사이에, 에탄올 다음, 물 다음, 2 % SDS에서 유를 세척한다. </li><li> RNA 추출 솔루션의 또 다른 100 μL, 소용돌이 10 초를 추가하고 실온에서 10 분 동안 배양한다. </li><li> 30 초 동안 소용돌이와 각 샘플의 tRNA의 20 NG를 추가합니다. </li><li> 1 분 동안 소용돌이와 클로로포름의 80 μl를 추가합니다. </li><li> 소용돌이가 격렬하게 30 초 및 RT에서 15 분 알을 품다. </li><li> 냉장 (4 ℃) 원심 분리기에서 19,000 XG에 15 분 동안 스핀. </li><li> coprecipitant으로 글리코겐의 20 μg을 함유하는 신선한 튜브에 조심스럽게 무색 위 수성 단계를 전송합니다. </li><li> 소용돌이와 100 % 이소프로판올 알코올의 200 μl를 추가합니다. </li><li> 15 ~ 30 초 동안 격렬하게 소용돌이 2 ~ 3 시간 동안 -20 ° C 또는 1 시간 동안 -80 ° C에서 RNA 침전물을 할 수 있습니다. </li><li> 19,000에서 30 분 동안 스핀4 ° C에서 XG, 상층 액을 제거한다. </li><li> 펠렛을 제거하는 차가운 75 %의 에탄올과 소용돌이의 450 μL로 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 4 ° C에서 19,000 XG에 10 분 동안 회전하고, 상층 액을 제거한다. </li><li> 5 분 후드 펠렛을 건조. </li><li> RNase가없는 물 10 μL로 펠렛을 재현 탁하고, 실온에서 10 분 알을 품다. </li><li> 분석 RNA 농도, -80 ° C에서 저장 또는 역방향 유전자 발현 분석을위한 표기. </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

이 논문은 해부 갑상선 형성으로 이어지는 복잡한 이벤트를 공부하고 더 잘 이해하기 위해 갑상선 외식 (E12.5) 또는 돌출부 (E14.5)를 배양하는 방법을 설명합니다. 인해 갑상선 ANLAGEN (정중선 anlage 및이 횡 ultimobranchial 체), 및 그 작은 크기, 인두 아치 동맥 E12.5 조직 지역화 주동이의 단편, 및 기관을 포함하는, 그러나 식도의 이중 원점 microdissected 있습니다. 도시 된 바와 같이, 사일의 기간 내에,이 ?...

갑상선 내피 모세 혈관의 밀도가 네트워크에 둘러싸여 여포라는 독립적 인 상피 분야의 모음입니다. 이 조직은 갑상선 기능 수 : 내피 모세관은 T3와 T4 호르몬 합성에 필요한 요오드와 thyrocytes를 제​​공하고, 몸 전체에 후자를 배포 할 수 있습니다. 모공과 모세 혈관 사이에 흩어져, C-세포는 1 칼시토닌 hypocalcemic 호르몬을 생산하고 있습니다. 성인 갑상선의 구조와 기능이 잘 알려져 있지만, 갑상선 배아 발달 (뿌리의 형성과 분화)에 관련된 세포 및 분자 메커니즘은 지금까지 이해되지 있습니다. 배 발생시, (C-세포의 전구 세포는 물방울 모양의 돌기로 E11.5에서 시작하는 동안 조상이 배아 일에 foregut의 내배엽의 복부 벽의 비후 (중간 선 anlage) (E) 마우스 배아에서 8.5으로 유래 thyrocytes ultimobranchial 보네 번째 인두 낭 2-6) 죽는다. 중간 선 봉오리는, 내배엽에서 분리 기관의 각 측면에 ultimobranchial기구와 E13.5에서 융합 양측으로 확장됩니다. 마지막으로, thyrocytes는 여포로 구성하고 C-세포는 분화. 갑상선 형성에 대한 현재의 지식은 주로 고정 된 조직의 조직 학적 분석을 제공하지만 갑상선 형성에 관여 형태 발생 이벤트는 매우 동적이며 다른 종류의 세포 사이의 세포 외 기질 (extracellular matrix)과의 통신 및 상호 작용을 포함한다. 최근 작품은 thyrocyte 전구 세포가 개발 갑상선에 내피 세포를 보충하는 VEGF의 높은 수준을 생산하고, 차례 차례로, 내피 세포가 모낭의 형성을 촉진하고 C-세포의 분화 7 모집 것으로 나타났다. 갑상선에있는 대부분의 생체 연구는 어느 차원 조직 배양 플라스틱 D에게 성장, 고립 된 성인의 갑상선 유래 세포에 수행 된ishes 또는 3D 행렬에. 문화의 이러한 유형의 차별화 된 모낭 세포 편광 유지하고 여포로 구성하거나 3D 조직 8-10을 다시 가져 오기를 사용하여. 그러나, 그들의 생리적 환경에서 외식 및 2D에서 배양 이러한 순수 상피 세포는, 세포 외 기질, 시토 킨, 성장 인자와 함께 그들이 일반적으로 생체 내에서 발생할 같은 내피 또는 신경 세포와 같은 다른 세포 유형의 상호 작용을 무시한다. 아주 좋은 연구는 최근 3 차원 매트 리겔 (11)에서 최종 배양 단계를 사용하여 갑상선 여포에 ES 세포의 분화 프로토콜을 설명했다. 그러나, 이러한 3 차원 배양은 다른 세포 유형과의 접촉이 부족하다. 췌장과 타액에 대한 이전의 전문 지식을 바탕으로 기관 배양 12-14, 마우스 배아 갑상선 ANLAGEN을 해부하고 semiporous 필터 또는 현미경 플라스틱 슬라이드에 외식을 배양하는 방법을 동맥이 개발되었다. 언제E12.5 배아 작업, 갑상선 ANLAGEN (중간 선 anlage 두 측면 ultimobranchial 기관)의 이중 기원은 조직의 큰 조각의 미세 절제를 부과했다. 이것은 기관 아니지만 식도를 포함하고, 조각으로 부서져 종기까지 인두 아치 동맥으로부터 연장. 필터상에서 배양하면 그들은 여전히​​ 좁은 지협에 의해 접속이 갑상선 돌출부를 형성하도록 ultimobranchial 체와 융합 여기서 정중선 anlage은 기관의 각 측면에 횡 방향으로 연장된다. 문화, 상피 세포 증식, 모낭에 정리하고 자신의 기원에 따라 thyrocytes와 C-세포로 분화. microdissected 조직에 포함 된 내피 세포는 증식하고 마지막으로 독립적으로 혈액의 흐름 또는 순환 요인의 상피 모낭 구조와 밀접하게 연관 갑상선 엽 (叶)에 침입. 외식의 개발은 충실하게 개발 생체 내에서 되풀이되었습니다으로, 표준이 문화 시스템은 형태 발생과 갑상선 개발 과정에서 발생하는 차별 사건을 연구하기에 최적입니다. 갑상선 조직은 야생형 녹아웃 또는 형광 형질 전환 배아로부터 수득 될 수 있고, 배양 시스템은 손실 및 기능 획득 실험 의무이다. 마지막으로, 현미경 플라스틱 접시에 형광 표지 갑상선 외식의 시간 경과 영상은 더 나은 생체 내에서 발생하는 반응 속도와 형태 형성 운동의 연속성을 조사하기 위해 악용 될 수 있습니다. 시간 경과 영상은 이미 췌장 15, 16 또는 ureteric 버드 (17)의 분기 형태 형성을 연구하는 데 사용되었습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="698">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">&#181;-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile</td>
			<td style="width:85px;">proxylab</td>
			<td style="width:119px;">80826</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen Type I, rat tail</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td>08-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td># 33010-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">M199</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>31150-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">HBSS</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>14025-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Tungsten wire</td>
			<td style="width:85px;">Goodfellow</td>
			<td style="width:119px;">LS237450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">culture plate insert (12 mm diameter)</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">GlycoBlue</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">E-cadherin</td>
			<td style="width:85px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">610182</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">Ezrin</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MS-661-P1</td>
			<td>1/400</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">PECAM</td>
			<td style="width:85px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">550274</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Hoechst</td>
			<td style="width:85px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo culture system to study thyroid development

갑상선은 갑상선 호르몬 T3, T4, 그리고 칼시토닌을 생산, 목의 기지에서 지역화 bilobated 내분비 선입니다. 칼시토닌은 모공과 모세 혈관의 밀도가 네트워크 사이에 산재 C-세포에 의해 합성되는 동안 T3와 T4는 여포라는 폐쇄 된 분야로 구성 차별화 thyrocytes에 의해 생성된다. 성인 갑상선 아키텍처 및 기능은 광범위하게 기술되고 연구되어 왔지만, &quot;angio-모낭&quot;단위, 실질에서 C-세포의 분포 및 상피와 내피 세포 사이의 주변 분비 통신의 형성은 작게 이해되는 것이다. 이 방법은 semiporous 필터 또는 현미경 플라스틱 슬라이드에 마우스 배아 갑상선 ANLAGEN 해부와 문화의 순차적 단계를 설명합니다. 사일의 기간 내에,이 배양 시스템은 생체 충실히 갑상선 발달 되풀이되었습니다. 사실, (I) 억원기관의 obation는 (E12.5 외식을 위해)가 발생, (II) 전구체는 여포로 구성하고 극화 (III) thyrocytes와 C-세포가 분화하고, (ⅳ) microdissected 조직의 증식에 존재하는 내피 세포가로 마이그레이션 thyrocytes 그들은 생체 내에서와 마찬가지로 밀접하게 갑상선 엽 (叶), 그리고, 상피 세포와 연결합니다. 갑상선 조직은 야생형, 녹아웃 또는 형광 유전자 변형 배아에서 얻을 수 있습니다. 또한, 면역 염색 및 RT-qPCR에 의해 생체 외 개발이 실시간으로 분석 할 수있다. 문화 항체, 성장 인자, 또는 세포 또는 배양 상청을 차단 억제제의 첨가에 의해 조작 될 수 이식편 또는 배양 언제든지. 하류 전체 마운트 또는 섹션 이미징 및 유전자 발현 프로파일 링 갑상선 O의 형태 형성과 분화 사건을 조작하고 공부를위한 강력한 시스템을 제공에 결합 된 결론, 갑상선 이식편 문화rganogenesis.

갑상선 anlages (중간 선 및 UB 함께 주위 조직과), 갑상선 엽 (叶)은 각각 E12.5 및 e13.5/e14.5에서 마우스 배아 (그림 1)에서 해부된다. 필터에 문화에서 하나의 하루를 보낸 후, 중간 선 anlage는 기관의 상단에 걸쳐 연장 된 조직으로 (그림 2A)를 볼 수 있습니다. 그것은 점진적으로 기관의 각 측면에 두 개의 엽 (叶)을 형성한다. 고립 된 갑상선 엽 (叶) (E13.5 또는 E14.5)이 배양, 그들?...

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An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 문화 시스템 갑상선 개발을 연구하는

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

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An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The Endocrine System

SCIENTISTS IN ACTION

11.4K 조회수.  Université catholique de Louvain & de Duve Institute. This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

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Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

조기 칙 태아 예 생체내 (새로운 문화)의 문화에 대한 방법

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

전 비켜</em이미징 및 미세 애플 리케이션에 적합> 치킨의 배아 문화 시스템

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

가스 투과 재료 기술로 HYPERStack 용기를 사용하여 닫힌 체계의 세포 배양 프로토콜

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

기본 인간 난관 상피 세포의 전의 VIVO 문화

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

위한 시스템<em&gt; 예 생체</em배아 췌장의&gt; 배양

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

소설<em&gt; 생체</em배아 마우스 사랑을&gt; 문화 방법

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

무 혈청 전체 배아 배양 시스템에서 마우스 배아 개발

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

에 대한 마우스 태아의 전체 소장 문화 시스템<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 신호 전달 경로와 융모 개발의 3 차원 라이브 영상의 조작

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

세포 - 세포 연락이없는 두 세포 유형의 삽입 공동 배양 시스템 개발

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...