이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)에서 보조금 RO1 CA 135561, R01 CA151494, R01 CA174432 및 P3013330에 의해 지원되었다. 우리는 토굴 격리 프로토콜 개발에 소중한 의견을 미셸 휴스턴, 엘레나 Dhima 박사 안나 Velcich에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 직접 각각 해마 시설을 운영하는 당뇨병 교육 및 NIH P60DK20541 지원 의학의 알버트 아인슈타인 대학의 연구 센터 박사 마이클 브라운 리 박사와 슈 리앙 뒤를, 감사합니다.

이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서의 권장 사항에 따라 수행되었다. 이 프로토콜은 의학의 알버트 아인슈타인 대학의 동물 실험 윤리위원회에 의해 승인되었다. 1. 크립트의 분리 및 문화 <ol><li> 소장에서 납골당의 분리 : <ol><li> 관심의 마우스 모델에서 장 지하실을 격리 할 것. 자궁 경부 전위 다음 CO 2와 쥐를 안락사. </li><li> 길이 방향으로 복부를 열고 얼음 차가운 인산염 완충 생리 식염수와 소장 (SI)를 작성, PBS (-ca 2 +; -Mg 2+) 2 배 항생제 항진균제 (안티 - 안티)와. 신속 소장을 격리 할 것. </li><li> 철저하게 메스를 사용하여 장간막 지방의 무료 해부. 조직을 관통하지 않도록주의 - 모든 시간은 얼음 차가운 PBS와 촉촉한 조직 유지에. INTE을 엽니 다스타 인 세로 방향으로 얼음 차가운 PBS로 깨끗이 씻어. </li><li> 미리 냉각 슬라이드를 사용하여 융모를 긁어 부드럽게, 두 부분으로 소장을 잘라 젖은면 팁을 사용하여 평평. 얼음처럼 차가운 PBS 여러 번에 적극적으로 씻으십시오. </li><li> 조직의 비 효소 분해에 대해 3mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) /0.5 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT) 당 1X PBS 20 ㎖의 3 분 부화. </li><li> 미리 냉각 슬라이드에 면도날을 사용하여 작은 조각 (2-4mm)로 조직을 잘라. 20 ml의 빙냉 PBS를 함유하는 50 ㎖ 튜브에 조각을 전송. </li><li> 피펫은 위아래로 부드럽게 10 배 10 ml의 멸균 일회용 피펫을 사용하여. 조직 조각이 중력에 의해 침전하자. 피펫으로 상층 액을 제거합니다. 세 개의 추가 번 반복; 확인 상층 액은 분명합니다. </li><li> 2 mM의 EDTA 당 PBS의 20 ML을 추가합니다. 소용돌이와 부드러운 락을 30 분 동안 4 ° C에서 배양한다. </li><li> 조직 침전물을하자 상층 액을 제거한다. 15 ml의 얼음 차가운 PBS 및 피펫 추가위로 10ml를 피펫으로 5 배 아래로. 조직 파편이 침전물하자 분수 1 (F1)과 상층 액을 수집합니다. F2-F5, 별도로 관리 각 부분을 수집 반복합니다. </li><li> 15 초 동안 손으로 격렬하게 15 ml의 얼음 차가운 PBS이 때 흔들림을 추가합니다. , F8을 F6를 수집하고 F7을 위해 반복합니다. 조직 조각이 떠 시작하면, 그들이 정착하기 위해 누릅니다. </li><li> 현미경 각 부분의 나누어지는을 검사합니다. 지하실을 포함하는 분획 풀. </li><li> 50 ML 튜브에 지하실을 수집, 70 μm의 나일론 셀 스트레이너를 통해 풀링 분수를 전달합니다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 100 XG에 원심 분리기, 15 ML 튜브에 2 배 안티 - 안티 및 전송 납골당 10 ml의 얼음 차가운 PBS에서 뜨는에 resuspend 펠렛을 폐기합니다. 세차를 한 번 더 반복합니다. </li><li> 배 안티 - 안티 - 10 ml의 얼음처럼 차가운 ADF, 고급 DMEM / F-12 (둘 베코 &quot;의 수정 이글 중간 / 햄&quot;의 F-12)로 한 번 지하실을 씻으십시오. </li><li> 한 번 납골당 10 ㎖를 씻어DF는 - 안티 - 안티 1 배. </li><li> 혈구를 사용하여 지하실을 계산합니다. 토굴 솔루션 볼륨을 조정하고 재현 탁 최종 토굴 농도가 젤라틴 단백질 혼합물 (마트 리겔)의 50 μL 당 100 ~ 500 지하실 될 수 있도록 1.5 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. 젤라틴 단백질 혼합물에서 4 ° C 및 재현 탁 지하실에서 5 분 100 XG에 원심 분리기. </li><li> 접시 토굴 50㎕의 - 24 웰 플레이트에 웰 당 단백질 젤라틴 혼합물을 현탁액 (성장 면적 : 2cm 2), 신중을 각 웰의 중앙에 현탁액 드롭을 배치. , CO 2의 서스펜션은 굳은 ~ 30 분까지 37 ° C 배양기를 접시를 유지한다. </li><li> 500 μl의 빙냉 완전 배양 배지 (고급 DMEM / 1X 방지와 F12 추가 - 안티 10 mm로 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES), 1X 루타, 1X B27 보충, 1X N2 보충, 1mM의 N-L 아세틸 시스테인 (NAC), 50 ng / ml의 상피 세포 성장 인자 (EGF), 100 / ㎖ ng를소량, 500 NG / ㎖의 R-Spondin). <ol><li> PBS 중 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)에 성장 인자를 재생성. </li></ol></li></ol></li><li> 크립트 Organoid 문화와 항로 : <ol><li> 항로 토굴 organoids 14-21일 포스트 시딩 (필요에 따라)은 다음과 같습니다 : <ol><li> 미디어 변경, 매주 금요일과 월요일. 수요일에, 새로운 미디어의 절반 미디어를 교체합니다. </li></ol></li><li> 문화 매체를 제거합니다. 5 분 간격으로 500 μL PBS로 두 번 샘플을 씻으십시오. </li><li> PBS를 제거하고 부드럽게 멸균 P1000 마이크로 피펫 팁을 사용하여 젤라틴 단백질 혼합물을 휴식. </li><li> 하나의 웰에 1 ml의 완전한 문화 매체를 추가하고 1 ml의 미디어 organoids를 재현 탁. </li><li> 부드럽게 피펫 팅과 20-30x 아래 P1000을 사용하여 organoids 중단 (일관성있는 기술까지 좋은 토굴 수익률 적절한 organoid 해리에 대한 현미경 검사 개발). </li><li> 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 지하실로 이동;4 ° C, 5 분에 100 XG에 원심 분리기. </li><li> 1 ml의 완전한 배양 배지로 두 번 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 웰 당 50 μl를 매트 리겔에서 필요에 재현 탁 지하실 등의 6 : 3 또는 1 : 1의 비율로 분할. (섹션 1.1.16-18) 전술 한 바와 같이 진행합니다. </li></ol></li><li> 크립트 Organoid 냉동 : <ol><li> 문화 매체를 제거합니다. 500 μL PBS에서 샘플을 씻으십시오. </li><li> P1000 피펫 팁을 사용하여 젤라틴 단백질 혼합물을 분산. </li><li> 하나의 웰에 1 ml의 미디어를 추가하고 1 ml의 미디어 organoids를 재현 탁. </li><li> 부드럽게 아래로 20-30x 피펫 팅에 의해 P1000을 사용하여 organoids를 휴식. </li><li> 1.5 ML 튜브에 organoids을 전송합니다. 4 ° C, 5 분 100 XG에 원심 분리기. </li><li> 1 ml의 완전한 배양 배지로 두 번 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 미디어를 동결 500 μL에 재현 탁의 지하실. </li><li> cryotube로 전송 지하실은 -80 ° C 냉동고 overni에 냉동 컨테이너 및 저장소에 튜브를 배치GHT. </li><li> 액체 N 2 탱크에 지하실을 전송합니다. <ol><li> 빠르게 37 ° C의 물을 욕조에 해동하여 냉동 토굴 organoids를 복구 할 수 있습니다. 상기 한 바와 같이 100 XG, 젤라틴 단백질 혼합물에서 5 분 및 재현 탁하고, 문화 500 μL로 완전한 문화 번 미디어, 원심 분리기를 씻으십시오. 더 나은 복구의 경우, 냉동 미디어 ROCK 저해제 (Y-27632)를 추가합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. 크립트 Organoid 대사 분석 <ol><li> 24 웰 플레이트 준비 : <ol><li> 분리 및 프로토콜 (토굴 격리 및 토굴 통로 섹션 1.2 섹션 1.1 참조)에 따라 납골당을 계산합니다. </li><li> 젤라틴 단백질 혼합물에 재현 탁의 지하실 (20 μL 당 100 ~ 200 납골당). </li><li> 24 웰 분석 플레이트 플레이트 토굴 - 젤라틴 단백질 혼합물 서스펜션 (각 샘플에 대한 최소한 삼중 거기 있는지 확인) 현탁액은 CO 2에서 37 ° C에서 응고시킬 것인큐베이터; 500 μL 전체 문화 매체를 추가 할 수 있습니다. </li><li> (1.1 절에 설명 된대로) 및 납골당이 완전히 개발 organoids으로 성장할 때까지 현미경으로 관찰 문화 지하실. </li></ol></li><li> 세포 외 유출 분석 : <ol><li> 밤새 비 이산화탄소 하이드레이트 카트리지 (0 %의 CO 2), 37 ° C 배양기. </li><li> 배지를 제거하고 500 ㎕의 DMEM 회 organoids 세척 (않고 : 글루코스, L 글루타민, 피루브산 나트륨 및 중탄산 나트륨과 함께 : 페놀 레드). 5 분을 기다립니다. </li><li> 각 웰에 잘 분석 매체 당 (DMEM 2 mM L- 글루타민 (L-glutamine), 5 mM의 D 글루코스) 675 μl를 추가합니다. </li><li> organoids 및 젤라틴 단백질 혼합물은 세척 후 손상되지 않도록 토굴 organoids 미세한 형태를 확인합니다. 비 CO 2에서 1 시간, 37 ° C 배양기를 품어. </li><li> 10 μM 주사 가능한 화합물 (oligomycin, 카보 시안화 메틸 -p- 플루오로 - 메 톡시 페닐 히드라 존 (FCCP)를 준비, Rotenone) 분석 배지에서. </li><li> 설정 카트리지를 카트리지 순차적으로 포트에 10 μM 주 화합물의 75 μl를로드하여 : 포트 - oligomycin을; 포트 B - FCCP; 및 포트 C는 - 로테 논 (분석 중 최종 농도 1 μM 될 것입니다). </li><li> 카트리지 30 분을 품어 - 37 ° C에서 1 시간을 비 CO 2 배양기에서. </li><li> 동시에, XF 분석기를 켜고 분석 프로토콜 템플릿을 만들 수 있습니다. </li><li> 카트리지를 &quot;보정&quot;XF 분석기로 카트리지와 유틸리티 플레이트를 삽입하고 실행합니다. </li><li> 그들은 젤라틴 단백질 혼합물에 부착되어 있는지 확인하기 위해 현미경 토굴 organoids를 확인합니다. </li><li> 악기와 실행 분석 프로토콜에로드 세포 배양 접시입니다. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Jemal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).</li><li>Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eating+patterns+and+risk+of+colon+cancer.">Eating patterns and risk of colon cancer.</a> Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li><li>Coles, N. W., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+metabolism+in+Ehrlich+ascites-carcinoma+cells.">Glutamine metabolism in Ehrlich ascites-carcinoma cells.</a> Biochem J. 83, 284-291 (1962).</li><li>Medina, M. A., Castro I, N. u. n. e. z. d. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaminolysis+and+glycolysis+interactions+in+proliferant+cells.">Glutaminolysis and glycolysis interactions in proliferant cells.</a> Int J Biochem. 22, 681-683 (1990).</li><li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+changes+in+cancer+cells+upon+suppression+of+MYC.">Metabolic changes in cancer cells upon suppression of MYC.</a> Cancer Metab. 1, 7 (2013).</li><li>Malmgren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinate+changes+in+histone+modifications,+mRNA+levels,+and+metabolite+profiles+in+clonal+INS-1+832/13+&#946;-cells+accompany+functional+adaptations+to+lipotoxicity.">Coordinate changes in histone modifications, mRNA levels, and metabolite profiles in clonal INS-1 832/13 &#946;-cells accompany functional adaptations to lipotoxicity.</a> J Biol Chem. 288 (17), 11973-11987 (2013).</li><li>Whitehead, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice.">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li><li>Roig, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+epithelial+cells+derived+from+human+colon+biopsies+express+stem+cell+markers+and+differentiate+in+vitro.">Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro.</a> Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+LGR5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake.">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li></ol>

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우리는 기저 속도 측정 후, 토굴 대사가 oligomycin, 카르 보닐 시아 나이드를 첨가하여 평가 하였다. 산소 소모율 (OCR) 및 8 개월 된 마우스로부터 단리 organoids 체외로 성장 소낭의 세포 외 산성화 레이트 (ECAR)를 테스트 순차적으로 -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)와 로테 논,. 29 분 (그림 2A와 2B) - 기저 OCR 및 기초 ECAR은 0에서 기록되었다. 29 일 분...

대장 암 (CRC)는 미국에서 암 관련 사망 원인 중 3 위를 차지한다. 산발적 인 대장 암은 - 즉 인생의 뒷부분에서 발생하는 (&gt; 50 세)와 명확한 걸리기 유전 적 요인과 -를 차지하고 ~ 강하게 장기식이 패턴 1, 2에 의해 영향을 발생으로 모든 경우의 80 %. 이 종양은 종양 세포의 증식 3-5의 높은 비율을 허용 아마도 운전하는 부분 (glutaminolysis을 통해) 사용 가능한 휴대 빌딩 블록과 에너지의 높은 농도를 만들 수 바르 부르크 효과로 알려진 산화 적 해당 작용에 대한 의존도를 향한 신진 대사 변화를, 전시 . 소장 암을 포함하여 대장 암에 대한 연구뿐만 아니라 다른 위장관 암 종양 형성의 원인으로 중요 통찰력을 제공. 탐지를 도울 수있다 위장 기관계의 정상 친 종양 및 종양 상태 사이의 차이를 조사 대사종양 발생에 대한 상대 위험뿐만 아니라 종양의 조기 발견 ermination. 또한, 미토콘드리아의 호흡과 당분을 포함하는 생체 에너지 대사를 이해하는 것은 세포 생리학, 노화 및 질병 상태가 장내 항상성을 교란하는 방법에 근본적인 통찰력을 제공 할 것입니다. 세포 외 플럭스 분석을위한 생체 에너지 분석 기술의 활용이 실시간으로 6,7 문화에서 성장 세포에서 동시에 미토콘드리아 호흡과 당분의 비율을 평가할 수 있습니다. 최근까지 소장의 시험 관내 연구는 양성 또는 악성 종양 중 -8,9- 유래 세포주에 한정되었고, 정상적인 장 상피의 생리 상주하는 미세 환경의 영향을 나타내지 않았다. 2009 년, 사토 등. (10)는 체외 배양 3 차원 (3D) 마우스 장내 상피 organoids를 성장 시스템, 또는 epith 소개실험 진단 및 치료 연구 (10, 11)에 적합 elial &quot;미니 용기&quot;. 또한, 열량 제한 쥐에서 분리 된 납골당은 문화 12 organoids 그들의 변화된 성장 특성을 유지한다. 형질 전환 된 세포주에 비해 토굴 organoid 배양 생체 상태를 이해하기 위해 훨씬 더 좋은 모델을 제시 생리 관련 데이터를 생성하는데 사용될 수있다. 우리는 장 토굴 organoids의 에너지 대사를 분석하는 생체 에너지 분석 기술을 적용. 마우스 장 토굴 organoids 제시 토굴 organoid 에너지 대사 연구 개발에 체외 배양 하였다. 산소 소비 속도 (OCR) 및 굴 organoids의 세포 외 산성화 레이트 (ECAR)가없는 두 개의 다른 대사 억제제 (oligomycin, 로테 논) 및 이온 담체 (보닐 시안화 메틸 -p- trifluoromethoxyphenylhydrazone)의 존재하에 측정 하였다. 토굴 ORGA이러한 화학 물질에 솔레노이드 대사 반응은 성공적으로 변화 ECAR 및 OCR 값을 반영했다. 셀룰러 바이오 에너지 연구는 암, 비만, 당뇨병, 대사 장애 및 미토콘드리아 질환 신진 대사 상태와 질병 위험과 표현형 사이의 상호 작용을 규명하고 병진 의학에 대한 직접적인 영향은 사전 심사 방법을 도움이 될 것입니다. 여기에, 우리는 상세한 프로토콜 소장 납골당을 분리하고 문화 토굴 organoids의 정보는 다음의 제품에 대해 설명합니다. 또한, 우리는 대사 분석을 위해 토굴 organoid 문화를 사용하는 새로운 방법을 소개합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1633">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free</td>
			<td style="width:229px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">356231</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">20012-027</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Advanced DMEM/F-12 (1X)</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">12634-028</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium without glucose, L-glutamine, Phenol Red, sodium pyruvate and sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">D5030</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Phenol Red sodium salt&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">P4758</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 15 mg / L in DMEM (D5030) - step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Antibiotic-Antimycotic, 100X, 100ml</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15240-062&#160;</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X or 2 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Penicilin-Streptomycin, liquid</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15140-122</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; GlutaMAX&#8482; supplement</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">35050061</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15630-080</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">N-Acetyl-L-Cysteine, 25g</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A9165-25G</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">100X N-2 supplement, liquid</td>
			<td style="width:229px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">17502-048</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">50X B-27&#174; supplement minus Vitamin A, liquid</td>
			<td style="width:229px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">12587-010</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50ug</td>
			<td style="width:229px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">3474-RS-050&#160;</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 500 ng / mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recombinant Murine EGF, 100ug&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">315-09&#160;</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 50 ng / mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recombinant Murine Noggin, 20ug&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">250-38</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 100 ng / mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; L-glutamine, 200 mM</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">25030-081</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; Glucose powder</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15023-021</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Ambion&#174; 0.5 M EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">AM9260G</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">DTT (Dithiothreitol), 1M</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">P2325</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 3 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A2058</td>
			<td style="width:456px;">0.1 % in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">16000-044</td>
			<td style="width:456px;">1 % in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recovery&#8482; Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">12648-010</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">ROCK inhibitor (Y-27632)&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">Y0503</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">O4876</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">C2920</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Rotenone</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">R8875</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">221465</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 0.1 N in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer)</td>
			<td style="width:229px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time analysis of metabolic profile in ex vivo mouse intestinal crypt organoid cultures

소장 점막은 두 가지 기본적인 구조로 구성 반복적 인 구조 전시 : 융모, 장 내강으로 돌출 성숙 장 세포, 술잔 세포와 enteroendocrine 세포 구성을; 및 점막하 근육 판과, 은닉 성체 줄기 및 전구 세포 및 성숙한 Paneth 세포 근위뿐만 아니라 간질과 토굴 미세 환경의 면역 세포를있는 소낭. 지난 몇 년 전까지의 소장 시험 관내 연구에서 양성 또는 악성 종양 중 하나로부터 유래 된 세포주로 제한하고, 정상적인 장 상피의 생리 상주하는 미세 환경의 영향을 나타내지 않았다. 여기서 우리는 사토 등의 알에서 적응하는 방법. (2009) C57BL / 6 마우스에서 파생 된 기본 마우스 장 토굴 organoids을 배양를 보여줍니다. 또, 측정에 의해 실시간으로 토굴 대사 프로파일을 분석하는 토굴 organoid 배양의 사용을 제시기저 산소 소비, 당분 레이트, ATP 생산 및 호흡 능력, 표준. Organoids는 소스에 의해 정의 된 속성을 유지하고 산소 소비와 세포 외 산성화 속도에 의해 반사 된 대사 적응의 측면을 유지합니다. 이 토굴 organoid 문화 시스템에서 실시간 대사 연구는 토굴 organoid 에너지 대사를 연구하는 강력한 도구이며, 어떻게이 영양과 약물 학적 요인에 의해 변조 될 수 있습니다.

크립트 organoids 8 개월 된 C57BL / 6 마​​우스에서 설립되었다가 영양 76A (AIN76A)의 설치류 다이어트 미국 연구소 정제 먹인. 장 토굴 organoids는 하나의 토굴 (그림 1A, 하나의 빨간색 화살표)에서 연장 된 기간 동안 문화에서 재배 할 수있다. Organoids 문화 18 ~ 20 일 (그림 1B, 빨간색 화살표)를 토굴 같은 구조를 성장. 납골당은 모든 삼주 계​​대하고 organoids 효율적으로 각각의 ...

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Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

소장 토굴 organoids 줄기 세포와 그 틈새에 의존 소낭의 성장을 되풀이 조직 배양 시스템을 제공하는 생체 외 배양. 우리는 기본 마우스 토굴 organoids에 실시간으로 대사 프로파일을 분석하는 방법을 설립했다. 우리는 organoids 자신의 소스에 의해 정의 된 생리 학적 특성을 유지했습니다.

대사 프로파일의 실시간 분석<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 마우스 장내 크립트 Organoid 문화

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

16.1K 조회수.  Albert Einstein College of Medicine.  소장 토굴 organoids 줄기 세포와 그 틈새에 의존 소낭의 성장을 되풀이 조직 배양 시스템을 제공하는 생체 외 배양. 우리는 기본 마우스 토굴 organoids에 실시간으로 대사 프로파일을 분석하는 방법을 설립했다. 우리는 organoids 자신의 소스에 의해 정의 된 생리 학적 특성을 유지했습니다. 

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Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

진핵세포 Polyribosome 프로필 분석

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

연구

생물학

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

생체내 이미징 및 난소암의 Orthotopic 마우스 모델에서 치료 트리 트먼트

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Zebrafish 태아의 대사 프로필 분석

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별<em&gt; 애기 장대</em&gt; 서스펜션 세포 배양

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding primary 3D epithelial structures in vitro. Both the architecture and physiological properties of these &#39;mini-guts&#39;, also called organoids, closely resemble their in vivo counterparts. This makes them an attractive model system for the small intestinal epithelium. Using retroviral transduction, functional genetics can now be performed by conditional gene overexpression or knockdown. This video demonstrates the procedure of organoid culture, the generation of retroviruses, and the retroviral transduction of organoids to assist phenotypic analysis of the small intestinal epithelium in vitro. This novel organotypic model system in combination with retroviral mediated gene expression provides a valuable tool for rapid analysis of gene function in vitro without the need of costly and time-consuming generation for transgenic animals.

This protocol explains primary Lgr5-positve organoid culture and the subsequent performance of retroviral transduction. This enables Cre-inducible overexpression or knockdown of the delivered transgene and allows functional studies to be carried out in the novel in vitro organotypic model system.

차 소장 Organoid 문화에서 레트로 바이러스 감염의 비디오 프로토콜

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

의 강성 측정<em&gt; 전의 VIVO</em원자 힘 현미경을 사용하여&gt; 마우스 대동맥

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.

장 내분비 세포의 굿 호르몬 분비의 연구 및 라이브 세포 이미징을위한 의도 된 쥐 소장의 혼합 차 문화

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant defense response to microbial elicitors and to wounding caused by chewing insects, eliciting systemic calcium signals in plants. However, the role of calcium in vivo during biotic stress is still unclear. This protocol describes the use of a genetically-encoded calcium sensor to detect calcium signals in plants during feeding by a hemipteran pest. Hemipterans such as aphids pierce a small number of cells with specialized, elongated sucking mouthparts, making them the ideal tool to study calcium dynamics when a plant is faced with a biotic stress, which is distinct from a wounding response. In addition, fluorescent biosensors are revolutionizing the measurement of signaling molecules in vivo in both animals and plants. Expressing a GFP-based calcium biosensor, GCaMP3, in the model plant Arabidopsis thaliana allows for the real-time imaging of plant calcium dynamics during insect feeding, with a high spatial and temporal resolution. A repeatable and robust assay has been developed using the fluorescence microscopy of detached GCaMP3 leaves, allowing for the continuous measurement of cytosolic calcium dynamics before, during, and after insect feeding. This reveals a highly-localized rapid calcium elevation around the aphid feeding site that occurs within a few minutes. The protocol can be adapted to other biotic stresses, such as additional insect species, while the use of Arabidopsis thaliana allows for the rapid generation of mutants to facilitate the molecular analysis of the phenomenon.

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

This protocol outlines a simple method for analyzing calcium signals in plants generated by feeding hemipteran insects, such as aphids. Arabidopsis thaliana transformed with the GFP calcium biosensor GCaMP3 allow for the real-time in vivo imaging of calcium dynamics with a high temporal and spatial resolution.

실시간 Vivo에서 녹음 애기 칼슘 신호의 곤충 먹이 형광 바이오 센서를 사용 하 여 중

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell (EC) proliferation assays using human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs) or isolated primary retinal ECs are widely used in vitro models to study retinal angiogenesis. However, isolating pure murine retinal endothelial cells is technically challenging and retinal ECs may have different proliferation responses than choroidal endothelial cells and different cell/cell interactions. A highly reproducible ex vivo choroidal sprouting assay as a model of choroidal microvascular proliferation was developed. This model includes the interaction between choroid vasculature (EC, macrophages, pericytes) and retinal pigment epithelium (RPE). Mouse RPE/choroid/scleral explants are isolated and incubated in growth-factor-reduced basal membrane extract (BME) (day 0). Medium is changed every other day and choroid sprouting is quantified at day 6. The images of individual choroid explant are taken with an inverted phase microscope and the sprouting area is quantified using a semi-automated macro plug-in to the ImageJ software developed in this lab. This reproducible ex vivo choroidal sprouting assay can be used to assess compounds for potential treatment and for microvascular disease research to assess pathways involved in choroidal micro vessel proliferation using wild type and genetically modified mouse tissue.

This protocol presents choroid sprouting assay, an ex vivo model of microvascular proliferation. This assay can be used to assess pathways involved in proliferating choroidal micro vessels and assess drug treatments using wild type and genetically modified mouse tissue.

안구 미세 혈관 신생의 전 비보 코로이드 발아 분석

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

오가노이드 유래 상피 단층: 장 장벽 기능을 위한 임상적으로 관련된 시험관내 모델

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...