우리는 교직원, 동문, 주민 및 브리검 여성 병원의 의사 조수, 이러한 연구를위한 조직이 사용할 수 있도록 대한 병리학과 주셔서 감사합니다. 이 작품은 NIH / 국립 암 연구소 (P50 CA105009, K08 CA108748, U01 CA152990), 난소암 연구 기금에서 연구 보조금에 의해 지원되었다 케이 재단, 노바티스 제약, 로버트와 데보라 우선 기금, 란디와 조엘 커틀러 난소암은 월 연구 기금, 마르샤 리브킨 재단 - 과학 학술 상, AACR - 조지와 암 유전학 연구 패트리샤 Sehl 원정대, 그리고 이스라엘의 의학에 대한 미국의 의사 원정대 - 클레어와 임마누엘 G. Rosenblatt 재단 부여합니다.

1. 콜라겐 준비 및 필터 코팅. <ol><li> 인간 placental 콜라겐을 준비하기 위해, 인간 placental 콜라겐 30 MG를 핀셋 및 저어 막대로 500 ML의 비커에 증류수 50 ML 맨 (DH 2 O)에 넣어. </li><li> 쉽게 용해 수 있도록 직접 콜라겐에 빙초산 100 μls를 추가합니다. 37 따뜻한 ° C와 콜라겐을 분해 그것을 저어. 그것은 20-30분에 용해한다. 콜라겐 가닥이 용액에 남아있는 경우, 필터 살균이 어려운 것입니다. </li><li> DH 2 O와 0.2 μm의 막과 필터 - 소독의 450 ML과 50 ML 주식을 희석. 이것은 최종 작업 솔루션입니다. 4 스토어 ° C. </li><li> 코팅 그들 콜라겐 (50-100 μl) 숙박과 함께하여 트랜 스웰 필터 세포막을 준비합니다. 냉장 콜라겐은 RT로 예열 후 야간 및 RT에서 막을 충당하기 위해 상단 구획에 추가합니다. 트랜 스웰 필터에 dissociated 기본 나팔관 (FT) 상피 (아래 참조)을 도금하기 전에, 1X 인산 세 시간이 초과 콜라겐을 제거하기 위해 사용하기 전에 생리 (PBS) 적어도 1 시간 버퍼 필터를 세척. </li></ol> 2. 조직 수집과 해리. <ol><li> 신선한 난관이 (FT) fimbria는 50 ML의 원심 관에 멸균 1X PBS의 수집 및 살균 조직 문화 후드의 처리를 프롬프트하기 전에 얼음에 보관해야합니다. </li><li> (샘플은 매체의 다른 유형의 수집 또는이 도금의 효율성에 영향을 수도 있습니다 가능한 한 많은 혈액과 외국 매체로 없애 적어도 3 배 피묻은 헛된되어있는 경우)되면 20 ML 차게 1X PBS에서 조직 샘플을 씻으십시오. </li><li> 살균과 멸균 핀셋 메스를 사용하여 약간의 PBS와 함께 10cm의 조직 문화 요리에 멸균 핀셋 전송 FT를 사용하여 상피 세포의 노출을 최대화하기 위해 길이 방향 절단. 그것이 더 이상 관하지만 조직의 거의 평면 시트하지 않도록 fimbria을 엽니다. 그런 다음 작은하지만 여전히 복구할 조각 (직경 3mm 정도)로 잘라. </li><li> 50 ML 튜브에 냉장 분리 미디어 45 ML (멤은 1.4 MG / ML Pronase 및 0.1 MG / ML DNAse을 포함)에 조각을 전송합니다. </li><li> 4 24~72시간에 대한 ° C에서 부드럽게 록. (경험 48 시간 최적입니다.) 슬라이드에서 분리 미디어 방울 넣어 분리의 양을 확인하고 clumping와 조직 생존 (속눈썹이있는 세포를 치고)의 금액을 확인하려면 다음과 같이하십시오. 당신은 하나의 세포 및 일부 작은 대단히 짧은 시간을 모두보고 싶어요. </li></ol> 3. 나팔관 도금. <ol><li> 상피 세포 분리의 양을 최적 때, FBS 10 % 볼륨을 추가하여 미디어를 inactivate. 작은 집합체에 세포 현탁액을 이동시키다 수있는 몇 번 반전. </li><li> 큰 조직 대단히 짧은 시간 (stromal 조직)가 하단에있는 튜브를 해결하실 수 있습니다. 두 번째 50 ML 관으로 상피 세포를 포함하는 미디어를 제거합니다. </li><li> 원래 50 ML 튜브에 추위 멤 50 ML (NO FBS)을 추가합니다. 추가 세포를 수집하는 반전. 삼분의 일 50 ML 튜브 (샘플 매우 큰이며 세포의 높은 숫자가 예상하는 경우,이 단계는 세포 수집을 최대화하기 위해 반복 수)에 미디어를 수집합니다. stromal / 세포외 조직의 큰 조각은 이제 폐기 수 있습니다. 이제 세포 현탁액의 두 50 ML 튜브 있습니다. 셀 알약에서 5 분 대기음 분리 미디어 1,000 rpm으로 원심 분리기. </li><li> USG 미디어 (DMEM : F12 2% USG, 1 % 펜 Strep과 보충)의 약 50-10 ML의 Resuspend 37 ° C.에 예열 부드럽게 피펫. 이 상피 세포를 손상과 문화의 품질을 줄일 수 있으므로 너무 적극적으로 피펫하지 않도록주의하십시오. 단일 세포와 작은 대단히 짧은 시간 (그림 1)이 있어야합니다. </li><li> 일시간 또는 최대 3 시간 최소 Primaria 문화 요리와 부화에 전송합니다. 섬유아 세포와 적혈구는 플라스틱에 집중되지만 FT 상피 세포가되지 않습니다. 게 튀어나와 있는지 한 시간 후 접시를 한 번 봐. 속눈썹이있는 세포의 존재는 속눈썹의 심장을 지적하여 볼 수 있습니다. </li><li> 이 부화하는 동안, 콜라겐 코팅 필터 (단계 1.4 참조) 세탁 및 세포 도금 준비 할 수 있습니다 </li><li> Primaria 접시에 부화 1~3시간 후, 15 ML 튜브에 세포 현탁액을 전송 5 ML USG 미디어 Primaria 접시를 씻어 15 ML의 최종 볼륨을 만들기 위해 관이 미디어를 전송합니다. 5 분 1,000 rpm으로 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 미디어를 기음과 세포 펠렛을 방해하지 마십시오. 펠렛의 크기에 의해 판단, USG 매체의 적절한 금액 resuspend. 당신이 필요한 경우 추가로 희석 수 있도록 (보통 1-3 ML 사이) 이하는 처음에 좋습니다. 부드럽게 Resuspend. </li><li> hemacytometer에 resuspended 세포의 10 μl를 추가하고 셀 밀도를 결정합니다. 팁 : 당신은 분명히 어두운 세포막을 가지고 있으며 이외의 원주 상피 세포 아르를 찾고 있습니다. 당신은 또한 확실히 이사 솜털이있는 세포를 셀 수 있습니다. 후광 appearan을 작은 세포CE는 적혈구이며 계산되지 않습니다. 몇몇 clumping, 그럼 당신은 당신이 셀 개수로 계산해야합니다. 시딩 대상은 1.65 X10 5 셀 / 멤브레인, 또는 75 % 이상 필터 범위 (그림 1)입니다. 세포가 너무 띄엄띄엄 도금하는 경우, 전지는 완전한 상피 층을 형성 수 없습니다. </li><li> 24 잘 접시 잘 하단에 USG 미디어 500 μl를 추가하고 트랜 스웰를 삽입합니다. FT의 세포 현탁액 (위 참조)의 요구 볼륨이 다음 각 막에 추가할 수 있습니다, 이것은 일반적으로 100 μl입니다. </li><li> 부화와 막의 방해없이 최고 1-2일에 대한 성장. 필요한 경우 그 기간 동안 기저 측면에있는 미디어를 변경할 수 있습니다. 1-2일 후, 당신은 신중하게 USG 미디어와 함께 정상을 씻어 막 위에 미디어를 소량 (50-100 μl)을 추가할 수 있습니다. 그것은 미디어가 현미경 전에 필터의 혀끝의 측면에서 제거하면 셀 문화의 합류를 결정하는 것이 더 쉽습니다. 낮은 칸막이는 항상 미디어를 포함해야합니다. 일단 문화가 (일반적으로 5 일 이내) 완전히 합류 있으며, 꼭대기의 양쪽으로 기초에서 필터를 통해 여행 미디어의 금액은 크지 않을 수 있습니다. </li><li> 처음 10 일 동안 매일 한 이틀 기저 미디어를 변경합니다. 낮은 칸막이는 항상 세포를 살리기 위해 미디어를해야합니다. 일단 세포들은 같은 immunofluorescence (IF) 또는 immunohistochemistry (IHC)와 같은 추가 연구에 사용할 수있는 꽉 상피 레이어를 (그림 1 및 2) 결성했습니다. </li></ol> 4. 막 처리. <ol><li> 멤브레인 처리 수행 될 연구의 유형에 의존하지만, 일반적으로 트랜 스웰 삽입에서 필터 제거를 포함한다. </li><li> 필터는 일반적으로 제거하기 전에 1X PBS 200 μl에 3 번 씻어 있습니다. </li><li> 필터의 혀끝의와 기초 측면에서 PBS를 대기음. 이것은 밖으로 건조에서 세포막을 방지하기 위해 한 번에 잘 한 일을해야합니다. </li><li> , 접시에서 삽입을 제거 그것을 거꾸로 뒤집어 및 멤브레인 주변 잘라 살균 메스를 사용합니다. 대신 가장자리 주변의 메스를 드래그의 멤브레인 가장자리 주위에 바로 상처를함으로써 한 조각의 멤브레인를 제거하려고합니다. </li><li> 트랙 세포가있는 측면의 유지, 삽입에서 필터를 제거하는 핀셋를 사용합니다. 필터는 다음 적절한 경우, IHC 등 처리할 수 있습니다. </li><li> 예 :이 연구는, 필터가 (적절한 항체로 고정, permeabilization, 차단 및 부화 후, 절차 IF 기준에 따라) 슬라이드에 배치해야한다면, DAPI와 Vectashield을 UP 직면 세포가 필터에 떨어뜨린이며 덮여 유리 coverslip. </li></ol> 5. 대표 결과 : 트랜 스웰 필터는 쉽게 immunohistochemistry (IHC)와 immunofluorescence (IF) 모두에 의해 전 생체내의 상피를 검사 제거할 수 있습니다. 특정 마커 혈통을 사용, 하나는 이미지를 수 있고 분비 (Pax8 긍정적)와 솜털이있는이 이러한 문화에 (Sall2 긍정적인) 세포 구획 (그림 3) 계량. 또한, 이러한 마커를 사용, 하나는 각 세포 유형이 다른 physiologic 신호 10 대응 방법을 모니터할 수 있습니다. 이 시스템은 다양한 자극에 대한 응답으로 FT의 상피의 secretome과 세포내 phosphoproteome의 변화를 특징 짓는 데 사용되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 그림은 인간의 기본 나팔관 조직에서 생성된하는 방법 예 생체내 문화 묘사. 나팔관 fimbrial 조직이 수술 스위트에서 얻은 및 24~72시간 2 분리 미디어 세탁 및 incubated 아르 작은 조각 하나를 생성하기 위해 다진입니다. 분리가 완료되면 조직 조각은 3 수확하는 부화 관의 바닥과 dissociated 상피 세포를 포함하는 미디어에 정착하기 위해 사용할 수 있습니다. 분리의 효율은 위상 대비 현미경 4에 따라 시험으로 모니터링할 수 있습니다. dissociated 상피 세포는 다음 fibroblast하고 결국에 상피 세포 5 admixed 조혈 세포를 제거하는 데 도움 Primaria 접시에 양식 있습니다. 비 상피 세포가 적절하게 제거되면, 상피 세포는 인간 placental 콜라겐 5 입혀져 있습니다 트랜 스웰 필터에 씨앗을 품고있다. 미디어는 아래에서 트랜 스웰 통해 확산에 의해 제공됩니다. 문화가 24-48시간에 대한 incubated하고 다음 혀끝의 미디어가 제거됩니다. 전 생체내 문화는 다음 트랜 스웰 필터에 완전한, 완벽한 잔디를 형성 5~8일위한 성장을 사용할 수 있습니다. 최대 4 주 동안 전 생체내 문화가이 상태에 viably 유지하실 수 있습니다. 만화 5 hemato로 삽입하고 스테인드에서 제거 필터의 예제와 함께 완벽하게 성장 전 생체내 문화의 표현을 보여줍니다xylin 및 eosin (H &amp; E)은 전 생체내의 상피의 극성과 건축을 설명합니다. <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. FT 전 생체내 문화의 명시야 현미경. 트랜 스웰 삽입이 인간 placental 콜라겐 0.4μm의 모공과 코팅 아르는 (a) 볼 수 있습니다. FT 상피 세포들은 상피 층 (C)을 형성 콜라겐 코팅 삽입 (B)에 양식 있습니다. 일부 파편은 일반적으로 솜털이있는 세포에 가장 자주 (화살표로 표시) 상피 문화에 세포 관찰 준수합니다. <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. FT 전 생체내 문화 immunofluorescence (IF).의 예는 예 생체내 문화의 이미지는 고정 및 항체 물들일 (A) 분비 (Pax8) 반대하고 (D) 솜털이있는 세포 (Sall2)는 마커 IF. DAPI는 세포 핵의 위치 (파란색) (B 및 전자)와 합병 항체 및 DAPI의 얼룩도 (C와 F) 표시됩니다위한 컨트롤로 사용됩니다. 세포의 숫자는 세포 (; Sall2 얼룩, 삼일 Pax8 얼룩, 7 일) 문화에 시간의 길이에 따라 다릅니다.

<ol>
	<li>Jemal, A., Siegel, R., Xu, J., Ward, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics.">Cancer statistics.</a> CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).</li><li>Markman, M., Walker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+chemotherapy+of+ovarian+cancer:+a+review,+with+a+focus+on+practical+aspects+of+treatment.">Intraperitoneal chemotherapy of ovarian cancer: a review, with a focus on practical aspects of treatment.</a> J. Clin. Oncol. 24, 988-994 (2006).</li><li>Liu, J., Matulonis, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+advances+in+ovarian+cancer.">New advances in ovarian cancer.</a> Oncology (Williston Park). 24, 721-728 (2010).</li><li>Cannistra, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+of+the+ovary.">Cancer of the ovary.</a> N. Engl. J. Med. 351, 2519-2529 (2004).</li><li>Kurman, R. J., Shih, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+pathogenesis+of+epithelial+ovarian+cancer:+a+proposed+unifying+theory.">The origin and pathogenesis of epithelial ovarian cancer: a proposed unifying theory.</a> Am. J. Surg. Pathol. 34, 433-443 (2010).</li><li>Fong, M. Y., Kakar, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+mouse+models:+a+summary+of+current+models+and+their+limitations.">Ovarian cancer mouse models: a summary of current models and their limitations.</a> J Ovarian Res. 2, 12-12 (2009).</li><li>Shan, W., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ovarian+cancer:+focus+on+genetics+and+animal+models.">Epithelial ovarian cancer: focus on genetics and animal models.</a> Cell Cycle. 8, 731-735 (2009).</li><li>Levanon, K., Crum, C. P., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+pathogenesis+of+serous+ovarian+cancer+and+its+clinical+impact.">New insights into the pathogenesis of serous ovarian cancer and its clinical impact.</a> J. Clin. Oncol. 26, 5284-5293 (2008).</li><li>Karst, A. M., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+pathogenesis:+a+model+in+evolution.">Ovarian cancer pathogenesis: a model in evolution.</a> J Oncol. 2010, 932371-932371 (2010).</li><li>Levanon, K., Ng, V., Piao, H. Y., Zhang, Y., Chang, M. C., Roh, M. H., Kindelberger, D. W., Hirsch, M. S., Crum, C. P., Marto, J. A., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ex+vivo+cultures+of+human+fallopian+tube+epithelium+as+a+model+for+serous+ovarian+carcinogenesis.">Primary ex vivo cultures of human fallopian tube epithelium as a model for serous ovarian carcinogenesis.</a> Oncogene. 25, 1103-1113 (2010).</li><li>Landen, C. N., Birrer, M. J., Sood, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+events+in+the+pathogenesis+of+epithelial+ovarian+cancer.">Early events in the pathogenesis of epithelial ovarian cancer.</a> J. Clin. Oncol. 26, 995-1005 (2008).</li><li>Vermeer, P. D., Einwalter, L. A., Moninger, T. O., Rokhlina, T., Kern, J. A., Zabner, J., Welsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+receptor+and+ligand+regulates+activation+of+epithelial+growth+factor+receptor.">Segregation of receptor and ligand regulates activation of epithelial growth factor receptor.</a> Nature. 422, 322-326 (2003).</li></ol>

박사는 노바티스 제약 Drapkin하는 컨설턴트입니다. 다른 저자들은 관심의 잠재적인 충돌을 선언하지 않습니다.

SOC에 대한 원산지 후보 사이트로 FT의 식별은 알려진 위험 요인과 실제 장액의 발암성 프로세스를 연결하는 메커니즘을 파악하기위한 기본 및 translational 연구 기회를 제공합니다. 이것에 대한 중요한 우리 FTSEC가 골반 묽은 carcinomas에 대한 세포 수준의 기원이라는 가설을 테스트 시작있게 다루기 쉬운 모델 시스템의 개발이다. 여기 설명되어있는 전직 생체내 문화 모델은 기본 FT의 상피의 형태와 생물을 보존하는 방식으로 기본 FT의 분비와 솜털이있는 세포의 분리 및 공동 문화를 허용하는 새로운 시스템입니다. 이 시스템을 사용하여, 우리는 최근이 상피의 secretome를 묘사 방법과 상피는 기계와 genotoxic 부상 10 응답합니다. 배란, 난소 tumorigenesis와 관련된 주요 위험 요인은 조직 손상, 염증 중재자, 성장 요인 및 호르몬 11 조합이 특징입니다. 이 시스템은 분비와 솜털이있는 세포의 반응과 생존에 ovulatory 환경의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 다른 세포 유형 (즉, 염증 세포)의 영향은 사건의 이해를하도록 검사 수 있다고 드라이브 셀 타입의 분화 및 이러한 세포의 종양 변화에 기여하는 요인. 비슷한 모델은 편광 상피가 존재하는 위치를 다른 조직에 설명되어있다. 예를 들어,기도 상피의 편광 차 문화에서 세포 성장과 세포 손상에 대한 응답에 heregulin의 효과는 12 평가했다. 모델 시스템의 이러한 유형은 상피 조직에서 발생하는 종양의 개시 및 pathogenesis을 연구하는 새로운 및 유용한 방법을 제공하고,이 같은 어떤 세포 라인은 현재 존재하지 FT 같은 조직에서 매우 중요하고, 큰 어디에있다 키 경로의 식별 및 새로운 치료 전략의 개발을 위해 필요합니다.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C7521</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM:F12 media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>15-090-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultroser G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Crescent Chemical Company</td>
<td>67042</td>
<td>Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration)</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Primaria culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>353802</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24 well Transwell Permeable supports</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning (Costar)</td>
<td>3470</td>
<td> Clear, 6.5 mm insert, 0.4 &mu;m pore size, treated polyester </td>
</tr>
<tr>
<td>MEM (Minimal Essential Media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pronase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11459643001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNAse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>DN25</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sall2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dr T. Benjamin, Harvard</td>
<td>Gift</td>
<td>1:20 dilution</td>
</tr>
<tr>
<td>Pax8 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Proteintech</td>
<td>10336-1-AP</td>
<td>1: 1000 dilution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

ex vivo culture of primary human fallopian tube epithelial cells

상피 난소암은 미국 여성의 암 사망률의 주요 원인이다. 다른 여성의 특정 암 대조적으로, 유방 및 사망 요금은 최근에 빠졌어요 자궁 carcinomas, 같은 난소 암 치료의 요금은 지난 20 년 동안 상대적으로 변하지 하나 남아있다. 이것은 수술과 화학 요법은 3, 2 가장 효과적인 초기 단계의 질병의 검출에 적합한 검사 도구의 부족으로 크게 때문입니다. 결과적으로, 대부분의 환자는 말기 질환과 확산 복부 참여와 함께 현재. 이것은 더욱 난소암 여러 histologic subtypes 4, 5와 이기종 질환이라는 사실에 의해 복잡합니다. 장액의 난소 암종 (SOC)는 가장 일반적이고 적극적인 subtype 가장 자주 BRCA 유전자 돌연변이의와 관련된 양식입니다. 이 분야에서 현재 실험 모델은 더 시작 유전 사건과 질병 6, 7 pathogenesis을 이해하는 암 세포 라인과 마우스 모델의 사용을 포함하고 있습니다. 최근 나팔관 기원 8, 9의 제안 세포로 난관 (FT) 분비 상피 세포 (FTSEC)와 SOC의 기원에 대한 새로운 사이트로 떠오르고있다. 더 셀 라인 FT의 상피 또는 FTSEC을 연구에 사용할 문화 시스템이 현재 없습니다. 여기 우리는 인간의 기본 FT 상피 세포가 자신의 건축, 극성, immunophenotype, 그리고 physiologic 및 genotoxic 스트레스에 대응을 보존하는 방식으로 양식하는 소설 전의 생체내 문화 시스템을 설명합니다. 이 전 생체내 모델은 종양이 조직에서 발생할 수 방법에 대한 이해를 수 있도록 SOC 연구를위한 유용한 도구를 제공하고, 메커니즘은 종양 개시 및 진행에 관여.

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Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

나팔관 (FT)는 묽은 난소 암종 (SOC)에 대한 원산지의 대체 사이트로 대두되고 있습니다. 이 프로토콜은 격리에 대한 새로운 방법을 설명하고<em&gt; 예 생체내</em난관 상피 세포&gt; 문화. 이 시스템 recapitulates<em&gt; 생체내에</em&gt; 상피 및 SOC의 pathogenesis의 연구를 수 있습니다.

기본 인간 난관 상피 세포의 전의 VIVO 문화

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

ex-vivo-culture-of-primary-human-fallopian-tube-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

19.6K 조회수.  Dana-Farber Cancer Institute. 나팔관 (FT)는 묽은 난소 암종 (SOC)에 대한 원산지의 대체 사이트로 대두되고 있습니다. 이 프로토콜은 격리에 대한 새로운 방법을 설명하고 예 생체내 문화. 이 시스템 recapitulates 생체내에 상피 및 SOC의 pathogenesis의 연구를 수 있습니다.

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Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

조기 칙 태아 예 생체내 (새로운 문화)의 문화에 대한 방법

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

Explants에서 들어라 기본 인간 기관지 상피 세포

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

사람의 피부에서 성인 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviral - 중재 최저 동안 예 VIVO</em인간 조혈 줄기 세포의> 적혈구 조혈

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

마우스 배아의 피부와 Melanoblast 이주의 라이브 영상의 생체 문화

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of airway cell differentiation and function. In the past few years, the use of lentiviral vectors for transgene delivery became common practice. While there are reports of transduction of fully differentiated airway epithelial cells with certain non-HIV pseudo-typed lentiviruses, the overall transduction efficiency is usually less than 15%. The protocol presented here provides a reliable and efficient method to produce lentiviruses and to transduce primary human bronchial epithelial cells. Using undifferentiated bronchial epithelial cells, transduction in bronchial epithelial growth media, while the cells attach, with a multiplicity of infection factor of 4 provides efficiencies close to 100%. This protocol describes, step-by-step, the preparation and concentration of high-titer lentiviral vectors and the transduction process. It discusses the experiments that determined the optimal culture conditions to achieve highly efficient transductions of primary human bronchial epithelial cells.

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

최적의 Lentivirus 생산 및 세포 배양 조건에 필요한 성공적으로 형질 도입 기본 인간 기관지 상피 세포

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II cells and two types of immune cells (i.e., human monocyte-derived macrophages [MDMs] and dendritic cells [MDDCs]). A protocol for assembling the multicellular model is provided. Alveolar epithelial cells (A549 cell line) are grown and differentiated under submerged conditions on permeable inserts in two-chamber wells, then combined with differentiated MDMs and MDDCs. Finally, the cells are exposed to an air-liquid interface for several days. As human primary immune cells need to be isolated from human buffy coats, immune cells differentiated from either fresh or thawed monocytes are compared in order to tailor the method based on experimental needs. The three-dimensional models, composed of alveolar cells with either freshly isolated or thawed monocyte-derived immune cells, show a statistically significant increase in cytokine (interleukins 6 and 8) release upon exposure to proinflammatory stimuli (lipopolysaccharide and tumor necrosis factor &#945;) compared to untreated cells. On the other hand, there is no statistically significant difference between the cytokine release observed in the cocultures. This shows that the presented model is responsive to proinflammatory stimuli in the presence of MDMs and MDDCs differentiated from fresh or thawed peripheral blood monocytes (PBMs). Thus, it is a powerful tool for investigations of acute biological response to different substances, including aerosolized drugs or nanomaterials.

Presented here is a protocol for primary human blood monocyte isolation as well as their differentiation into macrophages and dendritic cells and assembly with epithelial cells into a multicellular human lung model. Biological responses of cocultures composed of immune cells differentiated from either freshly isolated or thawed monocytes, upon exposure to proinflammatory stimuli, are compared.

유해 성 평가를 위한 상피 세포 및 1 차적인 면역 세포로 구성된 다세포 인간 폐포 모형

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

오가노이드 배양을 위한 인간 폐 상피 전구 세포의 분리 및 농축

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a multifactorial disease influenced by environmental and genetic factors, which lead to functional impairment of the retina due to retinal pigment epithelial (RPE) cell degeneration followed by photoreceptor degradation. An ideal treatment would include the transplantation of healthy RPE cells secreting neuroprotective factors to prevent RPE cell death and photoreceptor degeneration. Due to the functional and genetic similarities and the possibility of a less invasive biopsy, the transplantation of iris pigment epithelial (IPE) cells was proposed as a substitute for the degenerated RPE. Secretion of neuroprotective factors by a low number of subretinally-transplanted cells can be achieved by Sleeping Beauty (SB100X) transposon-mediated transfection with genes coding for the pigment epithelium-derived factor (PEDF) and/or the granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF). We established the isolation, culture, and SB100X-mediated transfection of RPE and IPE cells from various species including rodents, pigs, and cattle. Globes are explanted and the cornea and lens are removed to access the iris and the retina. Using a custom-made spatula, IPE cells are removed from the isolated iris. To harvest RPE cells, a trypsin incubation may be required, depending on the species. Then, using RPE-customized spatula, cells are suspended in medium. After seeding, cells are monitored twice per week and, after reaching confluence, transfected by electroporation. Gene integration, expression, protein secretion, and function were confirmed by qPCR, WB, ELISA, immunofluorescence, and functional assays. Depending on the species, 30,000-5 million (RPE) and 10,000-1.5 million (IPE) cells can be isolated per eye. Genetically modified cells show significant PEDF/GM-CSF overexpression with the capacity to reduce oxidative stress and offers a flexible system for ex vivo&#160;analyses and in vivo studies transferable to humans to develop ocular gene therapy approaches.

Here, a protocol to isolate and transfect primary iris and retinal pigment epithelial cells from various mammals (mice, rat, rabbit, pig, and bovine) is presented. The method is ideally suited to study ocular gene therapy approaches in various set-ups for ex vivo&#160;analyses and&#160;in vivo studies transferable to humans.

비 바이러스 유전자 치료를 위한 포유류 1차 안료 상피 세포의 격리, 배양 및 유전 공학

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...