우리 환경에는 주로 에스트로겐성 물질인 EDC 화학 물질이 많이 있습니다. 그룹에 속하는 물질의 화학적 다양성은 검출을 위해 다른 방법이 필요하기 때문에 테스트를 어렵게 만듭니다. 화학 구조에 따라, 물질이 실제로 에스트로겐으로 작동 할 수 있는지 여부를 결정하는 것은 정말 어렵다.
또한, 이러한 물질은 환경에 있는 순수한 형태로 결코 존재하지 않습니다, 그래서 그들의 효력은 그밖 화합물에 의해 영향을 받을 수 있습니다, 너무. 이 문제는 에스트로겐 효과를 보이는 바이오 모니터, 생체 표시기 유기체의 사용과 같은 효과 적 방언 방법에 의해 해결된다. 특정 유전자가 살아있는 유기체에 있는 에스트로겐에 민감하게 반응한다는 것을 알려져 있습니다.
분자 방법에 의한 유전자 제품의 검출은 단백질 또는 mRNA 수준에서도 가능하지만 일반적으로 동물 희생을 수반합니다. 동물 보호법은 점점 더 엄격해지고 있으며 대체 테스트 시스템에 대한 수요가 증가하고 있습니다. 교차 유전 기술은 이 발달과 형광 단백질의 발견과 함께 가능성을 나타내며, 바이오마커 생성의 방법이 포장되었습니다.
에스트로겐 민감한 유전자의 이러한 활성화의 도움으로 생체 내에서 테스트 할 수 있습니다. 이 비디오에서는, vtg:1mCherry 유전자 제브라피시 배아의 사용을 위한 가능한 방법이 2개의 화합물의 도움으로 에스트로겐 성 물질의 시험을 위해 표시되고 있다. 프로토콜은 바이오 마커 배아에 다른 화학 또는 환경 샘플의 에스트로겐 효과를 연구하기위한 배경 역할을 할 수 있습니다.
우리의 실험에 사용되는 제브라피쉬 라인은 비텔로게닌 기자 트랜스제닉 제브라피시 라인입니다. 이 라인은 Tol2 트랜스포슨 시스템을 사용하여 만들어졌습니다. 개발에 사용되는 트랜스진 구조는 긴 천연 비텔로게닌-1 프로모터 서열을 운반했으며, ERI 측면의 수가 많았다.
성적으로 성숙한 여성의 형광 신호의 발현은 연속적입니다. 그러나, 배아에 있는 남성에서, 그것은 단지 에스트로겐 성 물질의 행동 또는 존재에 의해 나타납니다., 그래서 후자는 테스트에 더 적합. 선의 배아의 감도와 유용성은 환경 샘플뿐만 아니라 여러 에스트로겐 화합물에서 테스트되었습니다.
살아있는 동물에 대한 모든 실험은 헝가리 동물 복지법에 따라 수행되었으며 동물이 무료 먹이 단계에 도달하기 전에 모든 연구가 완료되었습니다. 결합 탱크에 시스템 물을 채우고 계란을 수확하기 전에 짝짓기위해 물고기를 설정합니다. 수컷과 암컷 물고기를 탱크에 넣고 칸막이의 도움으로 분리합니다.
다음날 아침에 조명이 켜지면서 탱크에서 디바이더를 제거합니다. 짝짓기 탱크에서 15~20분마다 계란을 확인하십시오. 차 여조기 또는 조밀하게 짠 미세 메쉬를 사용하여 모든 배아를 수확하고 E3 버퍼 또는 명확한 시스템 물로 하나의 큰 페트리 접시에 결합합니다.
배아를 섭씨 25.5도로 설정하여 인큐베이터에 놓습니다. 1시간 반 후에, 수정되지 않은 계란을 제거하고 폐기하거나, 해부 현미경으로 플라스틱 이송 파이펫으로 부적절하게 분할된 계란을 폐기합니다. 처리 용기에 선택된 태아를 놓습니다, 예를 들면 페트리 접시 또는 조직 배양 판에, 이미 표지되고 시험 물질의 다른 농도로 채워졌습니다.
실험이 끝날 때까지 25.5°C에서 배아를 배양합니다. 치료 농도를 유지하기 위해 필요한 경우 시험 용액을 새로 고칩니다. 배아를 손상시키지 않도록 테스트 용액을 변경할 때주의하십시오.
MS 222를 미리 준비하십시오. 5일 된 애벌레를 처리 그룹당 5센티미터 페트리 접시에 플라스틱 파이펫을 넣습니다. 플라스틱 파이펫으로 애벌레에서 치료 용액을 제거한 다음 페트리 접시에 0.02 % ms 222 마취 용액의 2 밀리리터로 채웁니다.
특별히 디자인 된 10 센티미터 페트리 접시의 각 사각형을 4 % 메그라도스 ms 222로 채웁니다. 마취된 유충을 두 칸 중 하나에 약간의 물로 메그라스로 옮습니다. 첫 번째 광장에서 애벌레를 두 번째 사각형으로 옮킨다.
두 번째 광장에서 는 왼쪽으로 회전하고 오리엔트 유충을 넣고 마이크로로더 파이펫 팁이 최대 2센티미터까지 자른 상태로 부드럽게 아래로 누릅니다. 표현된 리포터의 신호를 평가하기 위해 배아를 동일한 보기 및 설정으로 이미지화한다. 페트리 접시를 현미경의 무대에 놓습니다.
배아의 간장에 초점을 맞추고, 관련 소프트웨어를 사용하여 밝은 필드 이미지를 캡처한다. 현미경을 mCherry 필터로 전환하고, 관련 소프트웨어를 사용하여 형광등 하에서 간 의 플로레스센트 이미지를 취합니다. 실험에서 모든 배아를 캡처할 때까지 이전 두 단계를 반복합니다.
ImageJ를 열고 이미지를 드래그앤드롭하거나 파일 열기를 클릭하여 분석할 형광 이미지를 업로드합니다. RGB 컬러 차트에 따라 플로리스트 필터로 만든 이미지를 분할하려면 이미지, 색상, 분할 채널을 클릭합니다. 빨간색 채널 이미지 스펙트럼으로 작업합니다.
다른 채널을 닫습니다. 이미지에 비슷한 크기의 타원형 영역을 지정하므로 전체 신호가 평가를 방해하지 않습니다. 타원형 도구를 사용하면 가능한 한 정확하게 강조 된 간 부위에 타원을 그립니다.
신호가 약한 경우, 광미세 이미지, 형광 화상의 밝은 필드 쌍을 사용하여 간 위치를 결정하십시오. 분석, 측정을 클릭하여 신호 강도와 영향을 받는 영역의 크기를 결정합니다. 통합 밀도 값은 차트의 소프트웨어 열에 의해 자동으로 계산됩니다.
치료 군내의 모든 배아의 모든 형광 영상을 분석할 때까지 이전 단계를 반복하여 분석을 계속한다. 데이터를 저장한 다음 통합 밀도 값을 분석합니다. 실험에서, 바이오마커 제브라피쉬 라인의 에스트로겐 민감한 배아는 5일까지 의고료화를 위해 알파 및 베타-제라롤레놀 또는 ZOL의 0.5 및 8 마이크로몰 농도로 처리되었다.
우리는 물질로 인한 실험이 끝날 때까지 물고기의 간에서 꽃발성 신호가 나타나는지 여부와 두 물질의 에스트로겐성에 차이가 있는지 여부를 조사했습니다. 결과는 형광 영상과 통합 밀도 값을 기준으로 평가되었다. 알파-ZOL의 경우, 가장 높은 시험 농도에서, 모든 개인은 사망했다.
따라서 이 경우 형광 신호를 검사할 수 없었습니다. 낮은 농도에서, 강한 형광 신호는 배아의 간에서 관찰 될 수있다. 형광 신호의 강도와 조명 영역의 크기에 큰 차이가 없습니다.
또한 통합 된 밀도 값과 치료 사이에는 유의한 차이가 없었습니다. 베타 ZOL로 치료하는 동안 사망률은 없었습니다. 물질 유도 된 모든 치료 농도에서 트랜스 진 활성.
형광 신호 강도의 증가, 및 조명 영역의 크기는 농도가 증가함에 따라 형광 이미지에서 관찰 될 수있다. 베타 ZOL의 통합 값을 검사하여 이 변경 사항도 검색할 수 있습니다. 평균 통합 밀도 값은 가장 낮은 값과 가장 높은 처리 농도 사이의 거의 두 배입니다.
그러나 베타-ZOL의 경우 개별 농도의 통합 밀도 값 간에 큰 차이를 찾지 못했습니다. 두 물질의 동일한 처리 농도로부터 얻어진 통합 밀도 값을 검사함으로써, 알파-ZOL은 형광 이미지에서 관찰되는 신호 강도 간의 차이와 일치하는 베타-ZOL에 비해 각 경우에 더 높은 통합 밀도 평균을 주었다고 할 수 있다. 모든 농도에서 중요 한차이.
에스트로겐 효과에 대 한 생물 지표의 사용은 독성 연구에서 확산 되었습니다. 에스트로겐 효과를 보여주는 여러 형질 전환선은 또한 제브라피시에서 생산되었습니다, 그 중 vtg:1mCherry는 우리의 연구에서 사용되었다. 여기에 설명된 방법은 순수 한 제제의 경우 에스트로겐 활성의 생체 내 검출을 허용하기 위해이 라인의 배아의 시험을 위한 가능한 프로토콜을 보여줍니다.
배아의 경우, 내인성 비텔로게닌의 생산과 유사하게 트랜스진의 발현이 큰 분산을 나타내며, 실험을 설계할 때 개별 감도의 차이를 고려해야 한다는 점을 언급하는 것이 중요하다. 치료 농도를 결정하는 중요한 측면은 간 세포를 포함한 배아의 세포가 높은 독성 물질의 농도에 의해 손상될 수 있다는 것입니다. 따라서 시험은 L-C 10 이하의 농도에서 수행되어야 합니다.
이 프로토콜은 계획된 테스트 끝점에 따라 여러 지점에서 변경될 수 있으며 테스트할 샘플에 대해 변경할 수 있습니다. 그것은 다른 테스트 방법, 예를 들어 분자 방법으로 완료 될 수있다. 따라서, vtg:1mCherry 라인의 사용이 에스트로겐성 시험의 모델로 나타나고 표준화된 시험 방법의 모델이 될 수도 있기를 바랍니다.
