이 프로토콜은 옥수수 미토콘드리아에서 기본 및 처리 된 성적 증명서의 매핑 및 차별에 사용됩니다. 이 기술은 RNA 정규화 단계를 포함하고 1 차및 처리된 성적증명서 사이 명확한 차별을 방해하는 불안정한 5개의 프라임 triphosphate의 영향을 최소화합니다. 옥수수 미토콘드리아 외에, 이 방법은 플라스티드 및 기타 식물 미토콘드리아에 적용 될 수있다.
먼저 20그램의 커널을 얼음 위에 50밀리리터 튜브로 모으십시오. 커널을 미리 냉각된 박격포로 옮기고 10~20밀리리터의 얼음 냉기 추출 버퍼를 추가합니다. 커널을 완전히 갈고, 추출 버퍼를 더 추가하고 필터 천의 두 층을 통해 지상 조직을 필터링합니다.
10 분 동안 8, 000 배 G에서 여과를 원심 분리합니다. 그런 다음 상체를 새 튜브로 옮기고 여과물을 폐기합니다. 10 분 동안 20, 000 배 G에서 튜브를 원심 분리합니다.
상체를 붓고 6 밀리리터의 세척 버퍼로 펠릿을 다시 중단합니다. Aliquot는 서스펜션을 5개의 1.5 밀리리터 RNase 프리 튜브로 인용하고 5분 동안 14, 000배 G에서 원심분리합니다. 상체를 버리고 미토콘드리아 펠릿을 액체 질소로 동결하십시오.
제조 업체의 지시에 따라 상용 시약을 사용하여 미토콘드리아 RNA를 추출하고 RNA 5 가지 주요 폴리 인산염 치료를 설정합니다. 이어서, RNA 정제 키트로 RNA를 회수한다. RNA 추출에 사용되는 시약은 위험합니다.
항상 연기 후드에서 작업하고 항상 실험실 코트와 장갑을 착용. 처리된 5개의 주요 폴리포스파아제 및 비처리 미토콘드리아 RNA의 동일한 양을 사용하여 2개의 순환화 반응을 준비합니다. 12-16시간 동안 섭씨 16도에서 두 반응을 모두 배양한 다음 이전에 사용한 RNA 정제 키트로 자체 계합 RNA를 회수합니다.
26 SCRT의 동일한 비율로 프라이머 혼합물을 준비하고 최대 7 개의 다른 역 전사 프라이머를 준비하여 시작합니다. 원고 방향에 따라 두 개의 역전사 반응 시스템을 조립하고 50 분 동안 섭씨 42도에서 배양하십시오. cDNA를 정상화하기 위해, 5개의 주요 폴리포스파타제 처리 또는 비처리 RNA에서 동일한 양의 cDNA의 2개의 PCR 반응을 준비하고 원고에 기술된 열순환 조건하에서 반응을 실행한다.
26S 성숙한 rRNA에 의한 정규화는 1차 및 처리된 성적증명서를 구별하는 중요한 단계이다. 두 PCR 제품의 풍부를 비교하고 필요한 경우 템플릿 cDNA의 양을 조정하여 정규화를 최적화합니다. 정규화된 cDNA의 적절한 볼륨과 5개의 프라임에서 대상 성적증명서의 3가지 주요 접합체와 같은 이가지 프라이머 한 쌍으로 PCR 반응을 준비하고 원고 방향에 따라 PCR을 수행한다.
그런 다음, 중첩 된 PCR에 의해 증폭되는 눈에 띄는 밴드를 분리하는 젤 DNA 복구 키트를 사용합니다. 표준 기술을 사용하여 젤 정제 PCR 제품을 벡터로 복제하고 콜로니 PCR을 수행하여 대상 인서트를 포함하는 양수 클론을 선택합니다. PCR 제품을 서열화하고 기본 국소 정렬 검색 도구 또는 BLAST를 사용하여 옥수수 미토콘드리아 게놈과 시퀀싱 데이터를 정렬합니다.
유기체 옥수수를 선택하고 데이터베이스 뉴클레오티드 수집을 검색합니다. 원형 성적증명서의 5개의 프라임에서 3개의 프라임 접합을 찾아 5개의 프라임 및 3개의 주요 성적증명서 테르미니의 위치를 결정한다. RNA 프로브를 준비하고 T7 프로모터, 17개의 염기 쌍이 삽입 부위의 상류에 포함된 이전에 사용된 벡터로 복제하는 데 사용되는 DNA 단편을 증폭한다.
RNA 프로브에 dig-11-UTP로 라벨을 지정하고 상용 키트를 사용하여 RNA 혼성화를 수행합니다. 정규화된 5가지 주요 폴리인세파아제 처리 및 비처리 RNA로부터 얻은 원형 RT-PCR 제품을 비교하여 1차 및 처리된 5개의 주요 끝을 차별한다. 그런 다음 매핑 결과를 기반으로 정량적 RT-PCR 프라이머를 설계하고 RT-PCR로 차별 결과를 확인합니다.
COX-2 유전자는 원형 RT-PCR 기반 전략으로 옥수수 미토콘드리아 전사체의 매핑 및 차별을 입증하는 예로 사용되었다. 정규화된 cDNA는 PCR용 템플릿으로 사용되었으며, 그 결과 5개의 주요 폴리포스파타제 처리 샘플에서 두 개의 저명한 밴드가 증폭되었습니다. 두 밴드는 COX-2 1과 2개의 젤에서 회수되어 벡터로 복제되었습니다.
콜로니 PCR 결과는 양성 클론이 가변 크기의 인서트를 포함하고 있으며, 이는 테르미니가 이질성 5개의 프라임 또는 3개의 프라임 테르미니를 가지고 있음을 의미한다. 시퀀싱 결과는 COX-2 1 과 2가 정지 코돈의 39 뉴클레오티드 하류에서 동일한 3개의 프라임 엔드를 가지고 있으며, 5개의 주요 종말은 각각 992 대 1, 030 및 1, 276 대 1, 283 뉴클레오티드 상류에 위치한 것으로 나타났다. RNA 젤 블롯 혼성화는 COX-2 1 및 2와 유사한 크기를 가진 원형 RT-PCR 매핑 결과 및 2개의 주요 대역을 검증하기 위해 수행되었다.
또 다른 쌍의 이산 프라이머는 RNA 젤 블롯으로 검출된 COX-2 3 및 4개의 밴드를 증폭하도록 설계되었지만 처음 원형 RT-PCR로는 그렇지 않았습니다. 정량적 RT-PCR 결과는 COX-2 1, 2, 3 및 4가 5개의 주요 폴리포스파타제에 민감하고 5개의 주요 테르미니를 가졌다는 것을 확인했습니다. 이 프로토콜에는 포함되지 않지만 프라이머 확장 분석을 수행하여 5가지 주요 매핑 결과를 확인할 수 있습니다.
