단지 결합 단백질만이 여러 생물학적 과정을 제어합니다. 이 FLAG-Biotin CLIP-seq 방법은, 따라서 전 세계적으로 포유류 세포에 있는 RNA와 RBP의 특수하고 측두측 배열을 프로파일로. 이 방법을 사용하면 SDS-PAGE 및 멤브레인 전달 절차 없이 직접 단백질 바인딩 된 RNA를 효율적으로 감지 할 수 있습니다.
전통적인 CLIP-seq에 비해 동위원소무료이며 단백질 특정 항체가 필요하지 않습니다. 10센티미터 판에 약 3백만 개의 마우스 배아 줄기 세포를 도금하고 하룻밤 동안 배양하는 것으로 시작합니다. 다음 날, 진공으로 매체를 제거하고 실온에서 2 분 동안 0.25 %의 트립신 EDTA의 2 밀리리터로 세포를 치료하십시오.
신선한 MESC 배지의 4 밀리리터로 트립신을 담금질하고 세포를 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 이송합니다. 그런 다음 원심 분리는 섭씨 4도에서 3 분 동안 300 회 G로 분리하고 상체를 제거합니다. 차가운 PBS의 4 밀리리터에서 세포를 중단하고 교차 연결을 위해 10센티미터 플레이트로 다시 전송합니다.
254 나노미터 UV 빛으로 세포를 방사한 다음 교차 연결된 세포를 15 밀리리터 튜브로 전달합니다. 이 세포를 섭씨 4도에서 3분 동안 300회 G로 회전한 다음, 원고 방향에 따라 준비된 버퍼 A의 500 마이크로리터로 셀을 분해합니다. 세포를 RNA가 없는 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 30~60분 동안 부드러운 회전으로 배양합니다.
10분 동안 37°C에서 DNAse 1의 30 마이크로리터로 lysate를 처리합니다. 이어서, 0.5 어금니 EDTA의 4개의 마이크로리터를 추가하여 반응을 중지한다. 불용성 펠릿을 섭씨 12, 000회 G에서 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리하여 스핀다운하고, 상체를 1.5밀리리터 튜브로 옮기십시오.
셀 리사테를 미리 평형된 FLAG 구슬로 옮기고 샘플을 섭씨 4도에서 배양하고 2~4시간 동안 회전합니다. 인큐베이션 후, 구슬을 3000회 G에서 2분간 원심분리하고 상퍼를 제거합니다. 500 마이크로리터의 버퍼 A를 샘플에 추가하고 섭씨 4도에서 5분간 배양한 다음 구슬을 회전시키고 상체를 제거합니다.
버퍼 A로 세척을 반복하고, 3개의 X FLAG-peptide로 미리 차가운 버퍼 B.To 두 개의 세척을 하고, 텍스트 원고에 설명된 대로 용출 용액을 준비하고 FLAG-구슬을 회전시한다. 좁은 끝 파이펫 끝으로 상체를 제거하고 각 샘플에 3개의 X FLAG 용출 용액의 200 마이크로리터를 추가합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 30분 동안 부드럽게 회전합니다.
그런 다음 3000 회 G.에서 2 분 동안 구슬을 스핀 다운하여 초탄을 신선한 튜브로 옮기고 용출을 두 번 반복합니다. 플래그 면역 침전의 효율을 확인하기 위해 서양 얼룩 분석 또는 은 염색용 용용액의 5%를 저장합니다. 뽑아낸 용액을 준비한 스트렙타비딘 구슬로 옮기고 샘플을 섭씨 4도에서 1~3시간 또는 하룻밤 동안 부드럽게 회전시합니다.
그런 다음 자기 스탠드에서 구슬을 수집하고 상체를 제거합니다. 완충 C 500 마이크로리터로 구슬을 세척당 5분간 부드럽게 회전하여 두 번 씻습니다. 다음으로, 완충 D의 500 마이크로리터로 두 번 구슬을 세척하고, 얼음 차가운 PNK 버퍼 500 마이크로리터로 두 번 세척하여 자기 스탠드에 구슬을 수집하고 세척 사이에 상체를 제거합니다.
부분 RNA 소화를 수행하려면 각 샘플 및 소용돌이에 100 마이크로리터를 추가하여 10분 동안 열 믹서를 사용하여 섭씨 37도로 설정합니다. 30초 동안 마그네틱 스탠드로 구슬을 수집하고 상체를 제거합니다. 그런 다음 원고 방향에 따라 PNK-EDTA 버퍼, 버퍼 C 및 PNK 버퍼로 세척합니다.
마그네틱 스탠드로 구슬을 수집하고 버퍼를 제거합니다. 그런 다음, CIP 반응 믹스를 추가하고 10 분 동안 열 믹서와 섭씨 37도에서 구슬을 소용돌이. 얼음 차가운 PNK EDTA 버퍼 500 마이크로리터로 구슬을 두 번 빠르게 씻은 다음 얼음 차가운 PNK 버퍼 500 마이크로리터가 있는 두 개의 세척을 합니다.
세차 후, 3개의 프라임 링커 계합 믹스의 40마이크로리터를 구슬에 넣고, 3시간 또는 1박 동안 열 믹서로 섭씨 16도에서 소용돌이를 피하십시오. 이 실험에서 링크러를 아군에 효율적으로 연결하는 것이 중요합니다. 반응 튜브를 가끔 확인하여 이러한 튜브가 결찰 중에 침전되지 않도록 하십시오.
인큐베이션 후 PNK EDTA 및 PNK 버퍼로 세차스를 반복하고, 구슬에 혼합된 PNK 의 마이크로리터 40을 추가하고, 10분 동안 열 믹서로 섭씨 37도에서 소용돌이를 피한다. PNK EDTA 및 PNK 버퍼로 구슬을 세척한 다음 텍스트 원고에 설명된 대로 RNA 격리를 진행합니다. 플래그 매개 또는 스트렙타비딘이 1단계 친화성 정화를 중재한 것과 비교하여, FLAG-Biotin 탠덤 정제는 간접 단백질 RNA 상호 작용의 오염을 피하면서 거의 모든 핵심 정제 단백질을 제거하였다.
LIN28 및 WDR43, Fbio CLIP-seq는 마우스 배아 줄기 세포를 사용하여 수행되었다. LIN28과 WDR43에 대해 총 약 770만 개와 220만 개의 고유 판독이 검색되었습니다. 트랙 뷰의 비교는 RN45 프리 rRNA 궤적에서 다른 바인딩 패턴을 보여줍니다.
LIN28, Fbio CLIP-seq 또는 식별에 의해 사전 let7g RNA의 GGA G 모티프에 교차 연결된 사이트. 더욱이, 결합 부위에서 농축된 RNA 모티브, 및 다양한 유형의 돌연변이에 있는 돌연변이 뉴클레오티드의 백분율이 결정되었다. LIN28이 유전자 뉴클레오티드에 결합하는 것을 선호한다는 것을 보여주는.
음, 오후 10:00에, 이 프로토콜은, 단백질 전용 복합체가 성공적으로 정제되었는지 확인하기 위하여 면역 강수량의 효율성을 확인하는 것이 중요합니다.
