HBX-DDB1 상호 작용은 cccDNA에서 HPV 전사를 촉진하기위한 중요한 단계이므로이 프로토콜은 HPV 기능적 치료법을위한 새로운 치료제를 발견하는 핵심 자산이 될 수 있습니다. 우리의 절차는 간단하고 화면으로 짧은 시간이 필요합니다. 내가 혼합하는 상호 작용은 세포 용해를 필요로하지 않고 실시간으로 검출 될 수있다.
또한, 높은 Z 프라임 점수로 스크리닝 품질이 만족스럽습니다. HBX-DDB1 상호 작용의 억제는 HPV 전사, 단백질 발현 및 cccDNA 생산의 억제를 초래하는 Smc5/6의 복원으로 이어집니다. 항 바이러스 작용의 이 새로운 기계장치는 현재 HPV 치료의 부적수를 극복할 수 있습니다.
단백질 단백질 상호 작용은 약물 표적의 중요한 클래스입니다. 여기에 설명된 분할 루시파라제 계산은 바이러스성 과 hasS 단백질 사이의 상호 작용을 표적으로 하고, 그밖 전염병을 위한 치료를 개발하기 위한 새로운 전략을 제공할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 간단하고 이해하기 쉽지만, 일부 단계는 시각적 데모없이 재현하기 어려울 수 있습니다.
따라서 시각적 데모는 프로토콜을 이해하는 데 큰 도움이 될 것입니다. 5회 HEK293T 셀을 5번 10밀리리터의 DMEM10밀리리터로 100mm 접시에 넣고 섭씨 37도에서 하룻밤을 배양하는 것으로 시작합니다. 다음 날, 총 300마이크로리터에 대한 DNA 플라스미드 및 DNA 응축 버퍼를 발현하는 HBx-LgBit 및 SmBit-DDB1의 각각 1마이크로그램을 희석시한다.
증강용 액액 16마이크로리터를 추가하고 1초 동안 소용돌이를 통해 튜브를 섞습니다. 실온에서 3분간 샘플을 배양한 다음 60마이크로리터의 트랜스페트 시약을 추가합니다. 튜브를 10초 동안 소용돌이시키고 샘플을 8분 동안 배양합니다.
한편, 세포와 접시에서 매체를 흡인하고 PVS의 다섯 밀리리터로 씻어. PVS를 흡인하고 DMEM의 7 밀리리터를 추가합니다. 분리 복합체를 사용하여 튜브에 DMEM의 3 밀리리터를 추가하고, 파이펫을 위아래로 혼합하고, 혼합물을 세포에 추가합니다.
그런 다음 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 10시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 소비된 배양 배지를 제거하고, PVS의 5밀리리터로 세포를 세척한다. 0.25%의 트립신 EDTA의 1 밀리리터에서 PVS를 제거하고 세포를 섭씨 37도에서 배양하여 분리합니다.
다음으로, DMEM의 4밀리리터를 추가하고, 세포 층의 표면을 여러 번 배관하여 배지를 분산시키고, 현탁액을 튜브로 이송한다. 5 분 동안 500 회 G에서 세포를 원심 분리 한 다음 상체를 버리고 PVS의 1 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 신약화를 반복하고 상체를 폐기합니다.
이어서, 밀리리터당 100만 개의 세포밀도로 10%FBS로 보충된 완충된 세포 배양 배지로 세포 펠릿을 다시 중단한다. 96웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액의 파이펫 50 마이크로리터, 10 시간 동안 37섭씨 인큐베이터로 세포를 반환합니다. 세포가 배양하는 동안, 스크리닝 화합물과 용매를 13.5 X 농도로 희석한다.
각 우물에 발광 기판12.5 마이크로리터를 추가하고 실온에서 5 분 동안 플레이트를 배양합니다. 발광계로 기준선 발광을 측정하고, 화합물의 5마이크로리터를 추가하고 제어된 DMSO를 각 웰에 즉시 추가합니다. 2시간 동안 30분마다 발광을 측정한 다음 DMSO 처리와 비교하여 화합물의 억제 효과를 계산합니다.
기준발광 신호를 측정하고 신호 대 배경 비율이 80보다 큰 것으로 계산되었다. Z 프라임은 0.5보다 컸으며, 이는 이 분석 시스템이 고처리량 스크리닝에 허용된다는 것을 나타냅니다. DMSO 전용 대조군에 비해 임계값을 40% 이상으로 설정함으로써, 니타조산이드는 후보약물로 확인되었다.
우리는 이전에 이 방법을 사용하여 반응성 소규모 화합물 라이브러리를 선별하여 HBX-DDB1 상호작용의 억제제로서 nitazoxanide를 확인했습니다. nitazoxanide를 사용 하 여, 우리는 HBX-DDB1 상호 작용의 억제, 바이러스 전사의 감소, 그리고 후속 바이러스 성 제품 수준을 확인 합니다. 표적 단백질에 융합된 분할 루시파아제의 최적 부분은 사전에 결정되어야 한다.
이 경우 HPX는 DDB1의 마지막 종착지에서 스몰 비트에 융합된 HPX와 DDB1의 C 종착기에서 큰 비트에 융합되어 최상의 결과를 제공했습니다.
