우리의 프로토콜은 소와 돼지에서 신장 추출물의 사용이 신장 생리학의 연구를 위한 우수하고 경제적인 자원이다는 것을 관찰합니다, 특히 혈관 내피 성장 인자와 그밖 분석물 사이 상관관계를 검토합니다. 그것은 항상 VEGF를 상관 관계 하는 도전 되었습니다., 장기 혈관 신생에 필수적인 성장 인자, 다른 단백질과. 이 기술은 우리가 VEGF와 호르몬과 같은 문무호르몬 사이 협회를 검토하는 것을 허용합니다.
이것은 확실히이 중요한 성장 요인에 대한 지식의 우리의 기초를 발전시킬 것입니다. 이 방법은 이 비디오에 언급된 것 외에 신장 피질 추출물의 다른 분석물을 상호 연관시키는 데 유용할 수 있다. 시각적 데모는 다른 사람들이 샘플링 오류 없이 재현 가능한 결과를 얻는 데 도움이 됩니다.
신선한 조직의 사용은이 기술의 성공에 필수적이다. 동물에서 도축 직후 신선한 전체 신장을 얻는 것이 중요합니다. 항상 얼음에 실험실에 조직을 전송합니다.
멸균 가위, 집게, 칼 및 페트리 접시를 사용하여 신장을 해부하고 필요한 조직 부분을 소비하십시오. 신장을 시상 평면을 따라 반으로 부드럽게 자르고 신장 의 중심에있는 피질 부위에서 조직 조각을 자릅니다. 칼을 가진 작은 조각으로 조직을 다진 얼음 차가운 1X RIPA 리시스 추출 버퍼의 1 밀리리터와 마이크로 퍼지 튜브로 전송합니다.
특정 샘플 세부 사항으로 튜브에 라벨을 부착하고 얼음 위에 놓습니다. 멸균 프로브가 있는 핸드헬드 균질화제를 사용하여 덩어리가 보이지 않게 될 때까지 조직을 1~2분 동안 균질화한 다음, 4도에서 5분간 9, 600배 g에서 튜브를 즉시 원심분리합니다. 원심 분리 후, 여러 동결/해동 주기를 피하기 위해 ELISA 및 총 단백질 분석을 위해 샘플의 별도의 알리쿼트를 준비합니다.
분석을 시작하기 전에 모든 시약과 분석 판을 실온으로 가져와 여분의 우물을 제거하고 추가 사용까지 섭씨 4도에 보관하십시오. 20X 세척 버퍼를 이중 증류수로 300 밀리리터로 희석하고 용액 없이 빈 우물을 설정합니다. 표준 또는 시료 50마이크로리터와 고추냉이 과로시다제 공주물 50마이크로리터를 각 우물에 즉시 추가한 다음, 각 우물에 50마이크로리터의 항체 용액을 즉시 추가하고 플레이트를 밀봉합니다.
접시를 섞고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 200 마이크로리터의 세척 버퍼로 각 우물을 씻으라. 각 우물에 기판 A와 기판 B의 50 마이크로 리터를 추가, 측면에 눌러 부드럽게 접시를 혼합, 다음 밀봉하고 37섭씨에서 15 분 동안 어둠 속에서 배양.
각 웰에 50 마이크로리터의 스톱 솔루션을 추가합니다. 부드럽게 접시를 누르고 분광계와 450 나노미터에서 흡광도를 읽습니다. 시약을 준비하고 버퍼를 미리 정한 다음, 각 웰에 표준 또는 샘플 100 마이크로리터를 추가하고, 접시를 밀봉하고, 잘 섞고, 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다.
각 우물의 액체를 제거하고 100 마이크로리터의 검출 시약 A.Seal 플레이트를 밀봉하고 한 시간 동안 배양하십시오. 다음으로, 400 마이크로리터의 세척 버퍼로 각각 잘 씻은 다음 각 우물에 90 마이크로리터의 기판 용액을 넣고 부드럽게 접시를 탭하고 섭씨 37도에서 다시 한 시간 동안 배양합니다. 마지막 인큐베이션 후, 각 우물에 50 마이크로리터의 스톱 용액을 추가하고, 부드럽게 플레이트를 누르고, 분광계로 450 나노미터에서 흡광도를 읽습니다.
표준 BSA 분석으로 소와 돼지 신장 추출물의 총 단백질을 추정하고 LH 및 VEGF-A-ELISA 결과를 정상화하기 위해 이 추정치를 사용합니다. LH와 VEGF의 평균 및 중간 수준은 동물과 남녀 모두에 대해 계산되었다. 데이터의 정상성을 확인한 후 선형 회귀 모델을 활용하여 LH와 VEGF 간의 관계를 검사했습니다.
LH는 소와 돼지 신장 모두에서 VEGF의 강력하고 중요한 예측변수로 밝혀졌다. 이 절차를 시도할 때, 각 조직에서 동일한 영역을 샘플링하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 유사한 절차는 조직의 모든 유형을 추출하는 데 사용할 수 있습니다.
사용 하는 어떤 조직의 총 단백질 추출 물으로 aalytes를 정상화 하는 것을 기억 하십시오.
