전체 게놈 시퀀싱, 게놈 채굴 및 분자 네트워킹은 우리가 여기서 설명하는 게놈 채굴 프로토콜을 질량 분석 가이드의 기초를 구성합니다. 그리고 천연 제품 발견에서 가장 현대적인 접근 방식입니다. 게놈 채굴 및 분자 네트워킹은 활성 분자에 의한 배꼽을 밝히기 위한 거대한 전망을 제공하는 원유 추출물의 화학 구조 조정 시그니처를 가진 전체 게놈 시퀀싱에 코딩된 주석에서 일치합니다.
원칙적으로, 게놈 마이닝은 실험 당 분자의 단일 또는 작은 그룹을 대상으로합니다. 따라서 느린 검색 률을 초래합니다. 이러한 의미에서, 분자 네트워킹과 함께 게놈 마이닝을 사용하는 것은 천연 제품 연구에 중요한 진보를 나타냅니다.
질량 분광법 가이드-게놈 마이닝은 원유 추출물로부터 대량의 데이터에 포함된 여러 화학형의 정보를 동시에 구성할 수 있는 다목적 방법입니다. 오늘날 세균, 곰팡이 또는 식물 서열을 탐구 할 수있는 고범위 방법론입니다. 화학형 생물정보학에 대한 유전자형 및 유전자형에 대한 화학형은 생합성 클러스터 와 소분자 제품 간의 연결이다.
프로토콜을 듣는 것은 연쇄상 구균 종의 대사 추출물에서 관찰된 배꼽 사이클 깊이 펩티드 제품을 특성화하는 것으로 입증된다. 그러나 곰팡이와 식물 시퀀스와 추출물에도 적용됩니다. 잘 선별된 게놈 데이터 세트를 갖는 것이 매우 중요하며 요즘 조각화된 초안 서열은 거의 완성된 서열 데이터에 의해 점점 더 대체되고 있습니다.
또한 새로운 생리 활성 천연 제품에 액세스하고 MS 가이드 접근 방식과 확실히 결합하기 위한 다양한 전략이 개발되었습니다. 천연제품 분리 및 구조적 해명 개선으로 이어질 것입니다. 여기서우리는 유전자형을 화학형 접근법에 연결하고 있기 때문에 생물정보학은 생합성 클러스터 와 작은 분자 제품 간의 연결고리가 매우 중요합니다.
화합물의 다양성과 클래스를 추정하고 게놈에 의해 인코딩합니다. 즉, 복제를 의미합니다. 나중에, 이온 유사성에 근거한 군집은 GNPS를 사용하여 미리 형성될 수 있습니다.
절차를 보여주는 것은 박사 레나타 시그리스트와 교수 앙골리니이 연구에서 내 협력자가 될 것입니다. 이차 대사 유전자 클러스터에 대한 실리코 정보에서 얻으려면 완전한 서열 게놈으로부터 주석을 수집합니다. 시퀀스 파일, 유전자 은행 E-M-B-L 또는 더 빠른 형식을 안티 스매시 플랫폼에 제출합니다.
따라서 가장 유사한 알려진 클러스터를 기반으로 출력 데이터에서 관심있는 유전자 클러스터와 같습니다. BGC의 DNA 서열 정보에 기초하여, 에코리 연쇄상구를 위한 유전자 클러스터를 측면에 있는 20-25뉴클레오티드 사이 의 설계 프라이머리. 인공 염색체 라이브러리 스크리닝.
원고에 따라 재조합 이종 유기체를 얻은 후, 적절한 발효 매체에서 균주의 100분의 1을 접종한다. 액체 ISP2 매체와 같은. 7일 동안 인큐베이터에 문화를 섭씨 30도, RPM 220도에 놓습니다.
접종 후, 원심 분리는 10 분 동안 2200 배 G에서 문화를 분리합니다. 셀을 버리고 상체를 분리 깔때기로 옮기십시오. 에틸 아세테이트와 쉐이크의 1부에 1개를 추가합니다.
유기 및 묵인 층이 분리될 때까지 1~3분 간 기다립니다. 그리고 에렌마이어 플라스크에서 유기 층을 수집합니다. MS/MS 데이터를 수집합니다.
제어 소프트웨어를 사용하여 적합한 HPLC 및 질량 분광법 방법을 프로그래밍합니다. MS/MS 네트워킹은 주어진 질량 분광 조건하에서 검출 가능한 분자 네트워크라는 점에 유의할 것입니다. 프로테아 마법사에서 MS 변환을 사용하여 질량 스펙트럼을 mzXML 형식으로 변환합니다.
변환에 대한 입력 매개 변수를 조정합니다. 변환된 LC-MS/MS 파일을 GNPS 데이터베이스에 업로드합니다. 두 가지 옵션을 사용할 수 있습니다.
파일 전송 프로토콜을 사용하거나 온라인 플랫폼을 통해 브라우저에서 직접 사용할 수 있습니다. GNPS에서 계정을 만든 후 생성된 계정에 로그인하고 분자 네트워크 만들기를 선택합니다. 직함을 추가합니다.
기본 옵션을 수행합니다. 분자 네트워크를 수행하려면 mzXML 파일을 선택합니다. 최대 6개의 그룹으로 구성합니다.
따라서 복제 루틴에 대한 라이브러리와 유사합니다. 전구체 이온 질량 내성 및 조각 다의 질량 공차는 각각 0.02 달튼과 0.05 달튼의 질량 공차성을 선택합니다. 고급 네트워크 옵션을 수행하려면 네트워크 클러스터 크기와 양식에 직접적인 영향을 미치는 매개 변수를 선택합니다.
고급 매개 변수는 GNPS 설명서에 있습니다. 작업이 완료되면 알림을 받고 작업을 제출하려면 전자 메일 주소를 선택합니다. GNPS 결과를 분석합니다.
GNPS에 로그인합니다. 작업을 열기 위해 작업을 선택합니다. 웹 페이지가 표시된 분자 네트워킹에서 얻은 모든 결과로 열립니다.
브라우저 네트워크 시각화 도우미에서 스펙트럼 패밀리 보기를 선택하여 모든 네트워크 클러스터를 확인합니다. 생성된 모든 분자 네트워킹 클러스터와 함께 목록이 표시됩니다. 잠정적인 분자 식별은 모든 ID에 표시됩니다.
표시를 선택하여 시각화합니다. 분자 네트워크 클러스터를 분석하려면 네트워크를 시각화합니다. 노드 레이블 상자에서 상위 질량을 선택합니다.
가장자리 레이블 상자에서 공동 서명 또는 델타 엠즈를 선택합니다. 노드 간의 노드 유사성 또는 질량 차이를 각각 관찰합니다. 다중 그룹 분석의 경우 노드 색칠 상자에서 파이 그리기를 클릭합니다.
각 노드가 각 그룹에 나타나는 빈도를 관찰합니다. 모든 라이브러리를 보려면 뷰, 모든 라이브러리, 조회를 선택합니다. GNPS 플랫폼에서 직접 조각화 스펙트럼을 엽니다.
또는 원래 원시 파일에서 수동으로 복제 화합물 및 관련 화합물의 구조 적 출화를 확인합니다. 이 프로토콜은 게놈 마이닝, 이종 식 및 MS 유도 코드 접근법의 조합을 사용하여 성공적으로 예시되었습니다. 새로운 전문 발리노마이신 과 아날로그 분자에 액세스합니다.
표적 valinomycin에 대한 분자 워크플로우에 게놈은 여기에서 제시됩니다. 크로마토그램은 발리노마이신, 몬타나스타틴 및 5개의 유사체가 이종영 숙주에서 발현, 생합성 유전자 클러스터 발현에 의해 생성되었다는 것을 보여주었다. 발리노마이신에 대응하는 분자 네트워킹 이온은 연쇄상 구균 종, CBM AI 20 4 2 개의 게놈에 음송된 해당 생합성 유전자 클러스터를 가진 이미 알려진 화합물이다.
먼저 발리노마이신 생합성 유전자 클러스터에 대해 기재된 유사체와 관련된 이온으로 군집된다. valinomycin 및 관련 유사체에 대한 MS 스펙트럼 및 화학 구조는 여기에 표시됩니다. 전체 게놈 시퀀싱 및 적절한 데이터 집합 큐레이팅을 수행하는 것은 MS-guide 게놈 마이닝을 위한 생합성 클러스터를 선출하는 첫 번째 단계이다.
전체 절차는 야생 유형 문자열 원유 추출물로 수행 할 수 있지만 관심의 유전자 클러스터를 선택하고 이종 발현을 촉진 할 수 있습니다. 상이한 방법은 DNA 샘플로부터 전체 생합성 유전자 클러스터를 포착하는 것으로 기술된다. 이 프로토콜의 가장 큰 장점은 대사 프로파일을 빠르게 복제하고 MS 데이터로 게놈 정보를 번식하는 능력입니다.
새로운 분자와 같은 이들을 해명하기 위해. 그리고 질량 가이드 게놈 마이닝은 도리스 차임과 동료에 의해 펩타이드 유전체학 및 글리코게놈의 분야에서 먼저 기술되었다. 그리고 NPS 통합 메타볼로믹스와 게놈 채굴 접근법이 도입된 후 분자 네트워크를 생합성 기능과 연결하는 가장 다재다능한 방법이 되었습니다.
