이 방법은 결장 상처 치유와 부상 후 발생하는 분자 및 조직학적 변화를 연구하기위한 이상적인 접근 방식을 제공합니다. 이 방법은 또한 IBD 병인에 빛을 비출 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 부상의 위치와 상처 치유 과정의 타이밍을 정확하게 제어하는 것입니다.
처음으로이 방법을 수행하는 개인은 마우스의 결장에 대장 내시경을 삽입하고 일관된 상처를 만드는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 이러한 기술을 반복적으로 연습하는 것은 이러한 문제를 극복해야 한다. 이 절차와 관련된 여러 조정된 단계와 뉘앙스를 감안할 때 이 메서드의 시각적 데모가 중요합니다.
절차를 시작하기 전에 내시경 칼집에 1.9 밀리미터 의 단단한 보어 내시경을 삽입하십시오. 그리고 제조업체의 지침에 따라 광원 및 비디오 이미징 장치에 조립된 내시경을 부착한다. 제공된 튜빙을 사용하여 작동 채널 옆칼집의 왼쪽에 있는 가스 밸브에 공기 펌프를 부착합니다.
작업 채널이 열린 위치에 있는지 확인하고 작업 채널을 통해 3 개의 프랑스 생검 집게를 삽입하십시오. 칼집에서 튀어나오지 않고 집집 끝까지 집집을 전진시키게 한다. 다음으로, 마취 된 마우스를 복부 측에 내시경 스테이징 플랫폼에 놓고 페달 반사에 대한 응답부족으로 적절한 수준의 체빙수준을 확인합니다.
눈 연고를 적용 한 후, 실온 PBS와 부착 된 쥐 개지 바늘로 3 밀리리터 주사기를 채웁니다. 그리고 바늘을 마우스의 항문에 약 1 센티미터 삽입하십시오. 대변 물질이 지워질 때까지 PBS를 부드럽게 주입하십시오.
여러 배설물 펠릿은 주입 된 PBS와 함께 마우스를 종료해야합니다. 조립된 내시경0.5센티미터를 항문으로 삽입하고 집게의 전체 턱이 칼집의 끝을 넘어질 때까지 생검 집게를 직장의 클리어 루멘으로 전진시키게 한다. 집게를 90도 돌리면 턱이 동서 방향으로 열리고 팁을 열고 약 1센티미터의 집게를 발전시키고, 생검을 수확하기 위해 부드럽고 빠른 움직임으로 집게를 닫고 철회합니다.
생검을 수행하는 동안 결장전체를 부풀리지 않으려면 가스 밸브의 오른쪽을 열어 둡니다. 생검 직후, 대장내시경 기록 장치에 부착된 발 페달을 우울하게 하여 비디오 녹화를 시작합니다. 그리고 가스 밸브의 오른쪽에 집게 손가락을 단단히 눌러 개구부를 완전히 덮어 내시경으로 공기를 강제로 밀어 내시경으로 밀어 넣고 결장으로 넣습니다.
닫혀있는 위치에있는 동안 칼집에서 다시 직장 루멘으로 집모를 철회. 그리고 턱의 베이스가 시야의 상단 가장자리와 정렬 될 때까지 즉시 상처 위에 직장 벽에 집게를 배치합니다. 상처의 명확한 보기를 관찰 할 때까지 결장완전히 팽창 계속.
상처 침대의 최상의 측정을 얻으려면 인내심을 가지고 대장내시경을 정확한 각도로 배치하여 상처 침대의 최상의 이미지를 얻을 수 있습니다. 적절한 소프트웨어 프로그램에서 비디오를 열고 상처 침대가 쉽게 시각화 할 수있는 시간을 보여주는 프레임으로 비디오를 진행합니다. 그리고 닫힌 집게가 상처 침대 위와 직장 벽에 대고 있는 경우 벽이 팽팽합니다.
매 번 이 프레임의 스냅샷을 가져오고 파일 이름을 코딩하여 상처 침대의 측정이 눈먼 방식으로 수행되도록 합니다. 상처 침대의 크기를 정량화하려면 ImageJ에서 이미지를 열고 프리 핸드 선택 도구를 사용하여 상처 주위의 경계를 그립니다. 분석에서 측정값을 선택합니다.
그리고 해당 측정값은 결과 창에 자동으로 채워집니다. 모든 측정값을 획득한 경우 스프레드시트의 0일 크기에 비해 후속 일에 대한 상처 크기를 계산합니다. 적절한 실험 적 종점에서, 실험 동물의 신체 구멍을 노출하고 결장 아래에 폐쇄 된 집게를 배치하기 위해 피부와 복부 근육 층을 엽니 다.
결장은 부드럽게 근본적인 장간에서 그것을 풀어 내고 마우스에서 그것을 수집하기 위하여 그것의 중간점에서 그리고 항문에서 조직을 잘라냅니다. 얼음 차가운 PBS로 채워진 20 밀리리터 주사기를 사용하고 쥐 게이지 바늘을 장착하여 배설물 내용을 씻어내도록 하십시오. 그리고 지워진 결장부분을 필터 용지 에 놓습니다.
장간측이 필터 용지에 얼굴을 아래로 향하게 하는 것을 주의하여, 콜론을 세로로 엽니다. 그리고 파스퇴르 파이펫을 사용하여 점막을 0.2 % 메틸렌 블루로 덮습니다. 몇 초 후, 여분의 얼룩을 빼내고 상처 침대를 찾기 위해 해부 현미경으로 결장본.
4 인치 마이크로 아이리스 가위를 사용하여 침대 가장자리 주위를 자르고 근육 층으로 자르지 않도록주의하십시오. 그리고 미세 점 핀셋을 사용하여 해부된 조직을 튜브로 이송하여 스냅 동결 및 저장을 합니다. 적절한 실험 적 끝점에서, 필터 종이, 막진측의 조각에 세로로 수확 된 결장.
선택의 고정으로 조직을 부드럽게 덮습니다. 70%에 탄올에 보관하기 전에 4~6시간 동안 밀봉된 용기에 파라필름으로 조직을 덮습니다. 처리 당일, 파라막을 제거하고 조직에 0.2% 메틸렌 블루를 첨가하여 입증하였다.
과도한 얼룩을 배출 한 후, 상처 침대를 찾기 위해 해부 현미경 아래에 조직을 배치합니다. 숫자 10 블레이드가 있는 메스를 사용하여 상처 침대의 중심을 직접 절단하고 결장이 반으로 절단되는 직선으로 결장의 나머지 부분을 계속 절단합니다. 극저온절을 위해, 메스에 의해 절단된 측이 조직 동결 배지로 반으로 채워진 기저금형에 얼굴을 아래로 향하게 하는 결장 조각을 포함한다.
미세 핀셋으로 조직을 고정하고 동결 매체를 경화시키기 위해 금속 판이나 두꺼운 알루미늄 호일에 베이스 몰드를 놓습니다. 배지의 바닥 부분이 동결되면, 실온에서 동결 매체로 베이스 몰드의 나머지 부피를 채웁니다. 그리고 전체 조직 블록이 동결 될 때까지 금형을 드라이 아이스로 반환합니다.
그런 다음 단면까지 금형을 섭씨 80도까지 옮춥시게 합니다. 여기서, 상처 침대의 크기와 상처의 폐쇄율을 정확하게 정량화하기 위해 상처 침대의 허용 가능한 뷰의 대표적인 이미지가 표시됩니다. 상처 침대의 이 전 생체 권에서, 상처 침대의 둘레의 표시기 및 단면시 상처 침대의 시각화를 가능하게 하는 조직을 절단하는 위치를 관찰할 수 있습니다.
이 대표적인 이미지에서는 상처 침대의 H 및 E 얼룩 부분을 명확하게 관찰할 수 있습니다. 상처 치유율의 정확한 평가를 보장하기 위해 항상 상처 침대의 인스턴트 이미지를 획득하는 것이 중요합니다. 핀치 생검에 이어, 관심있는 다른 에이전트는 상처 치유율에 미치는 영향을 테스트하기 위해 상처 침대에 주입 될 수 있습니다.
