ICO 또는 ICO-seq는 미생물에 대한 고처리량 RNA 시퀀싱의 첫 번째 적응입니다. 이 방법은 게놈 전체 규모에서 미생물 기능을 평가했습니다. 엔지니어링 된 미생물의 경우,이 방법은 미생물 게놈의 변화가 어떻게 기능을 방해 할 수 있는지 설명 할 수 있습니다.
현탁액 배양으로부터 효모를 얻고 혈종계를 사용하여 세포를 계산합니다. 밀리리터당 약 750, 000세포의 농도로 PBS에서 세포를 다시 중단한다. 다음으로, PBS에서 초저융점 아가로즈를 섞고, 아가로즈가 녹을 때까지 90°C에서 혼합물을 가열한다.
아가로즈 혼합물을 부착된 0.22 미크론 필터로 주사기에 적재합니다. 섭씨 80도로 설정된 스페이스 히터 앞에 주사기 펌프를 놓고 주사기를 펌프에 놓습니다. 효모 현탁액으로 두 번째 주사기를 채우고 3 분의 주사기를 불소 오일로 채우고 2 %의 이온 형광 활성제로 채웁니다.
두 주사기를 주사기 펌프에 적재합니다. 주사기에서 튜브를 장치 A.Place 에 얼음 양동이에 넣고 콘센트 튜브를 원물 튜브로 안내합니다. 각 주사기의 유량을 설정하고 15 밀리리터 원뿔 관에서 약 1 밀리리터의 에멀젼을 수집합니다.
튜브에서 아가로즈가 설정될 때까지 5분을 기다린 후, 에멀젼에 불소 오일에 20%의 퍼플루오로-옥타놀을 동일한 부피를 추가합니다. 원추형 튜브를 몇 번 반전시켜 에멀젼과 퍼플루오로 옥타놀을 섞는다. 2분 동안 2, 000배 G에서 깨진 에멀젼원심을 원심분리합니다.
하이드로겔이 오일 및 PFO 단계 위에 펠릿이 있는지 확인하십시오. 오일 및 PFO 단계를 제거합니다. 하이드로겔을 다시 일시 중단하려면 두 밀리리터의 tet(W) 버퍼를 추가합니다.
서스펜션을 새로운 15밀리리터 원판 튜브로 옮는다. 2 분 동안 2, 000 배 G에서 튜브를 다시 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 다시 테트(W)로 하이드로겔을 중단합니다.
하이드로겔을 2, 000회 G에서 2분간 회전한 후 효모 배양 배지의 2밀리리터로 하이드로겔을 다시 중단한다. 튜브를 섭씨 30도에서 하룻밤 동안 배양하고 흔들어 보냅니다. 각 균주는 다른 속도로 성장합니다.
적절한 미디어와 잠복기를 선택하는 것은 효모가 하이드로겔 내에서 자라도록 보장하는 데 필수적이지만, 과잉 성장하지 않아 세포가 미디어로 빠져나갑니다. 먼저 하이드로겔을 15밀리리터 원내 튜브로 옮는다. 2 분 동안 2, 000 배 G에서 튜브를 원심 분리합니다.
하이드로겔을 PBS로 두 번 씻은 다음 구형 버퍼에 한 번 씻으시다. 구형 완충액에서 구형 효소의 40배 희석을 수행합니다. 그런 다음, 하이드로겔에 희석 효소의 1 밀리리터를 추가합니다.
하이드로겔 튜브를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 처리된 효모는 더 투명하게 보일 것입니다. 하이드로겔 서스펜션을 함유한 튜브로부터 튜브 의 바닥에서 서스펜션의 0.8 밀리리터를 인출하고, 1밀리리터 미수 주사기로 옮기다.
주사기를 3D 프린팅 주사기 홀더에 놓습니다. 주사기와 홀더를 2분, 000배 G로 원심분리합니다. 진행하기 전에 하이드로겔이 주사기 바닥에 단단히 포장되어 있는지 확인하십시오.
15 밀리리터 원물 튜브에 240, 000 방울 세크 구슬을 놓습니다. 1 분 동안 1, 000 배 G에서 튜브를 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 500 밀리머 나트륨 염화나트륨으로 0.9x 효모 용해 버퍼의 2밀리리터에서 구슬을 다시 중단합니다.
교반 바를 삽입하고 비드 서스펜션을 3밀리리터 주사기로 옮기습니다. 불소 오일에 PFPE-PEG 계면활성제의 여러 밀리리터를 포함하는 또 다른 주사기를 준비합니다. 이전에 준비된 효모 클론 포장 하이드로겔의 주사기를 획득한다.
묵인 머리를 대피하고 주사기를 캡. 세 주사기, 하이드로겔, 비드 서스펜션 및 오일을 주사기 펌프에 삽입합니다. 튜브를 통해 주사기를 캡슐화 장치인 장치 B에 연결합니다.
콘센트 튜브의 끝을 얼음 위에 50밀리리터 원피스 튜브에 넣습니다. 각 주사기의 유량을 설정합니다. 약 1, 000 밀리리터의 에멀젼을 수집하거나 하이드로겔이 남지 없을 때까지 장치를 실행합니다.
그런 다음 cDNA 합성, 라이브러리 준비 및 시퀀싱을 위한 드롭 세크 프로토콜을 따릅니다. 미세 유체 장치를 사용하여 효모 세포는 160 마이크로미터 물방울로 캡슐화되었습니다. 8배의 스플리터는 이 방울을 8개의 60마이크로미터 물방울로 나누었다.
하룻밤 잠복은 하이드로겔의 일부 내에서 성장하는 동위 원소 효모 식민지 결과. 효모 하이드로겔을 제2 미세 유체 장치에 적재하기 전에 세포벽을 소화하기 위한 용액에 세척되어 침지되었습니다. 적절한 소화는 현미경 검사법에 의해 확인되었으며, 치료된 효모 세포는 더 반사적인 형태를 갖는 것으로 확인되었습니다.
리시스 버퍼에서 mRNA 포획 구슬의 스트림은 제2 미세 유체 장치의 낙하 접합 전에 근접 팩 효모 하이드로겔의 스트림과 혼합되었다. 그 결과 에멀젼에서, 수집된 물방울의 약 10%는 lysed 콜로니를 가진 하나의 비드를 포함시켰다. 이러한 동종 식민지 시퀀싱 워크플로우는 C.albicans의 백색 불투명 스위칭 반응을 분석하는 데 사용되었습니다.
주 성분, PC, 분석 및 tSNE 치수 감소는 샘플 데이터 세트와 참조 데이터 세트 사이의 일반적인 일치를 나타냈다. TSNE 분석은 세포의 3개의 클러스터를 밝혔습니다. 클러스터 2는 주로 샘플 데이터 세트에서 셀로 구성되었지만 클러스터 0과 하나는 두 샘플모두에서 셀로 구성되었습니다.
tSNE에서 WH11 표현을 오버레이하면 클러스터에 흰색 식민지가 포함될 가능성이 있음을 나타냅니다. STF2 표현식은 클러스터 하나에서 이전에 얻은 데이터와 일치하여 증가했습니다. 클러스터 0과 2에서 WH11 및 STF2는 클러스터 에 비해 크게 하향 조절되었습니다.
Androgen 미생물은 다양한 질병을 치료하기위한 생물학적 제제를 대량 생산할 가능성이 계속 증가하고 있습니다. 이 절차에 따라 다양한 생물정보 학적 도구를 적용하여 시퀀싱 데이터를 추가로 분석 할 수 있습니다.
