ICO, o ICO-seq es la primera adaptación de la secuenciación de ARN de alto rendimiento a los microbios. Este método evaluó la función microbiana a una escala de todo el genoma. Para los microbios diseñados, este método puede dilucidar cómo los cambios en el genoma microbiano pueden perturbar sus funciones.
Obtener levadura de un cultivo de suspensión, y contar las células utilizando un hemociclomekil. Re-suspenda las células en PBS a una concentración de aproximadamente 750.000 células por mililitro. A continuación, mezclar el punto de fusión ultrabaso en PBS, y calentar la mezcla a 90 grados Celsius, hasta que la agarosa se derrita.
Cargue la mezcla de agarosa en una jeringa, con un filtro de 0,22 micras adjunto. Coloque una bomba de jeringa delante de un calentador de espacio establecido en 80 grados Celsius y coloque la jeringa en la bomba. Llene una segunda jeringa con la suspensión de levadura y llene una tercera jeringa con aceite fluorado, con fluorosurfactante 2%iónico.
Cargue ambas jeringas en las bombas de jeringa. Conecte el tubo de las jeringas al dispositivo A.Coloque un tubo cónico de 15 mililitros en un cubo de hielo y guíe el tubo de salida hacia el tubo cónico. Ajuste el caudal de cada jeringa y recoja aproximadamente un mililitro de emulsión en el tubo cónico de 15 mililitros.
Después de esperar cinco minutos para que la agarosa en el tubo se ajuste, añadir un volumen igual de 20%perfluoro-octanol en aceite fluorado a la emulsión. Mezclar la emulsión y el perfluoro-octanol invirtiendo el tubo cónico unas cuantas veces. Centrifugar la emulsión rota a 2.000 veces G durante dos minutos.
Asegúrese de que los hidrogeles se hayan peletó por encima de las fases de aceite y PFO. Retire las fases de aceite y PFO. Añadir dos mililitros de tet(W)buffer para volver a suspender los hidrogeles.
Transfiera la suspensión a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar el tubo de nuevo a 2.000 veces G durante dos minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los hidrogeles en tet(W) de nuevo.
Después de girar los hidrogeles a 2.000 veces G durante dos minutos, vuelva a suspender los hidrogeles en dos mililitros de medio de cultivo de levadura. Incubar el tubo durante la noche a 30 grados centígrados, con temblor. Cada cepa crece a diferentes velocidades.
La elección de un medio adecuado y el tiempo de incubación es esencial para asegurar que la levadura crezca dentro del hidrogel, pero no crezca en exceso, lo que lleva a que las células escapen a los medios. Primero, transfiera los hidrogeles a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar el tubo a 2.000 veces G durante dos minutos.
Lavar los hidrogeles dos veces con PBS y luego una vez en el tampón de esferoplastado. Realizar una dilución 40x de enzima esferoplastante en tampón de esferoplastia. A continuación, agregue un mililitro de la enzima diluida a los hidrogeles.
Incubar el tubo de hidrogeles a 37 grados centígrados durante una hora. La levadura tratada se verá más transparente. Del tubo que contiene la suspensión del hidrogel, retire 0,8 mililitros de la suspensión de la parte inferior del tubo y transfiéralo a una jeringa sin tapar de un mililitro.
Coloque la jeringa en el soporte de la jeringa impresa en 3D. Centrifugar la jeringa y el soporte a 2.000 veces G durante dos minutos. Antes de continuar, asegúrese de que los hidrogeles estén apretados en la parte inferior de la jeringa.
Coloque 240.000 cuentas drop-seq en un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar el tubo a 1.000 veces G durante un minuto. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas en dos mililitros de 0,9x tampón de lisis de levadura, con cloruro de sodio de 500 milimolar.
Inserte una barra de agitación y transfiera la suspensión del cordón a una jeringa de tres mililitros. Prepare otra jeringa, que contenga varios mililitros de surfactante PFPE-PEG en aceite fluorado. Obtener la jeringa previamente preparada de hidrogeles envasados en clones de levadura.
Evacúe el cabezal de aquiescencia y acarree la jeringa. Inserte las tres jeringas, los hidrogeles, la suspensión del cordón y el aceite en las bombas de jeringa. Conecte las jeringas a través del tubo al dispositivo B, el dispositivo de encapsulación.
Coloque el extremo del tubo de salida en un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo. Ajuste el caudal de cada jeringa. Recoger aproximadamente 1.000 mililitros de emulsión, o ejecutar el dispositivo hasta que no queden hidrogeles.
A continuación, siga el protocolo drop-seq para la síntesis de ADNc, la preparación de la biblioteca y la secuenciación. Usando un dispositivo microfluídico, las células de levadura se encapsularon en gotas de 160 micrómetros. Un divisor de ocho veces dividió estas gotas en ocho gotas de 60 micrómetros.
La incubación nocturna dio lugar a colonias de levadura isogénicas que crecen dentro de algunos de los hidrogeles. Antes de cargar los hidrogeles de levadura en el segundo dispositivo microfluídico, fueron lavados y sumergidos en una solución para digerir las paredes celulares. La digestión adecuada fue verificada por microscopía, con células de levadura tratadas con una morfología más reflexiva.
Una corriente de perlas de captura de ARNm en el tampón de lelisis se mezcló con una corriente de hidrogeles de levadura de paquete cercano antes de la unión de fabricación de gotas del segundo dispositivo microfluídico. En la emulsión resultante, alrededor del 10% de las gotas recogidas contenían un cordón con una colonia de lesed. Este flujo de trabajo de secuenciación de colonias isogénicos se utilizó para analizar la respuesta de conmutación opaca blanca de C.albicans.
El componente principal, el PC, el análisis y una reducción de la dimensionalidad tSNE indicaron la concordancia general entre el conjunto de datos de muestra y un conjunto de datos de referencia. El análisis TSNE reveló tres grupos de células. Mientras que el clúster dos estaba compuesto predominantemente de celdas del conjunto de datos de muestra, los clústeres cero y uno estaban compuestos de celdas de ambas muestras.
La superposición de la expresión WH11 en el tSNE indicaba que el clúster probablemente contenía colonias blancas. La expresión STF2 aumentó en el clúster uno, de acuerdo con los datos obtenidos anteriormente. En los clústeres cero y dos, WH11 y STF2 fueron significativamente regulados hacia abajo en comparación con el clúster uno.
Los microbios de andrógenos tienen un potencial cada vez mayor para producir en masa productos biológicos para el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades. Siguiendo este procedimiento, se puede aplicar una variedad de herramientas bioinformáticas para analizar más a fondo los datos de secuenciación.
