특정 신경 인구 또는 뇌 영역의 광유전학 적 조작으로, 행동은 자유롭게 움직이는 동물에 있는 높은 시간 및 공간 해상도로 수정될 수 있습니다. 만성 이식 된 광섬유와 함께 다른 광유전학 도구를 사용하여 다양한 신경 변조 및 행동 테스트를 수행 할 수 있습니다. 광유전학의 궁극적인 목표는 행동하는 동물에 있는 높은 시간적 및 공간 해상도를 가진 신경 회로의 변조입니다.
약리학적 또는 전기 적 조작과는 달리, 광유전학은 신경 회로에 특정 세포 모형의 정확한 통제를 허용합니다. 광유전학은 거동 중에 특별히 정의된 영역에서 특정 세포 유형을 표적으로 하고, 그러한 미세 회로의 변화의 직접적인 영향을 면밀히 조사하는 완벽한 방법입니다. 우리는 이제 자유롭게 움직이는 마우스에서 광유전학을 준비하고 심고 수행하는 방법을 단계 안내하는 단계를 제시할 것입니다.
광학 임플란트의 준비를 위해 세라믹 페룰 플랫 사이드를 벤치 비스에 올려 놓습니다. 섬유 스트리핑 도구로 200 마이크로미터 직경의 유리 섬유의 코드를 제거하고 세라믹 섬유 서기관으로 2~3센티미터 의 비조각을 잘라냅니다. 유리 섬유 조각을 세라믹 페룰에 넣은 다음 주사 캐넌트 캐넌트로 평평한 면에 슈퍼 글루를 떨어 뜨립니다.
세라믹 페룰의 둥근 면에 유리 섬유를 가능한 한 짧게 자르고 프리 임플란트를 ferrule 연마 퍽에 배치하여 4개의 다른 출판 용지에서 둥근 면을 연마합니다. 그 후, 세라믹 페룰의 평평한 면에 유리 섬유를 절단, 이식에 필요한 길이로. 마우스 뇌 아틀라스를 사용하여 임플란트의 길이를 계산합니다.
임플란트는 관심 영역 바로 위에 끝나야 합니다. 이식 전에 마취가 적용됩니다. 정확하고 미적 기법은 원고에 설명되어 있습니다.
마우스가 마취의 깊은 상태에 도달하면 가열 판에 놓고 고정 프레임에 머리를 고정합니다. 앞면의 코와 치아를 고정하고 양쪽의 귀를 고정합니다. 컵로 폰을 마우스 뒤쪽에 미묘하게 바르고 양눈에 불투명한 눈 연고를 바르면 건조로부터 보호하십시오.
젖은 종이 타월로 두피에 머리카락을 적신 다음 가위를 사용하여 잘라냅니다. 젖은 종이 타월로 느슨한 모든 머리카락을 제거하십시오. 면 스틱을 사용하여 요오드가 함유 된 팅크로 두피를 소독하십시오.
트위저로 관심 지역에 대한 두피를 올리고 중간선을 따라 1센티미터를 자른다. 이식을 위해 두개골을 거칠게 하려면 흉터에 소량의 인산을 바르고 15초 동안 효과를 발휘하십시오. 면 봉으로 모든 산을 제거하고 염화 나트륨으로 흉터를 두 번 헹구습니다.
적절한 주입을 위해 개별 좌표에 대한 F 계수를 계산합니다. 스테레오틱 프레임에 유리 통을 놓고 브레그마 바로 위에 배치합니다. 이제 좌표 계열이 0이고 유리 캐뉼라를 람다로 옮습니다.
다음 수식으로 F 계수를 계산합니다. 브레그마 마이너스 람다가 4.2로 나눈 것은 F 계수와 같습니다. 정확한 좌표는 주입 및 이식에 매우 중요하기 때문에 그렇지 않으면 잘못된 구조가 자극되면 행동 효과가 특이하지 않습니다.
모든 마우스는 두개골 의 크기에 최소한의 편차를 가지고, 따라서, 계수는 절대적으로 필수입니다. 조정된 좌표를 사용하여 흉터의 위치를 관심 구조 바로 위에 찾습니다. 주입 캐뉼라를 사용하여 그 자리에서 캐뉼라를 회전하여 두개골에 구멍을 뚫습니다.
주사기에 연결된 유리 캐뉼라에 바이러스 용액을 넣려면 두개골에 염화 나트륨 한 방울과 피로펜 한 조각을 위에 놓습니다. 피로펜에 두 개의 마이크로 리터 바이러스 용액을 떨어 뜨리고 유리 캐뉼라의 끝을 바이러스로 낮춥니다. 음의 압력을 적용하고 바이러스 솔루션이 캐뉼라에 의해 채택 될 때까지 기다립니다.
캐뉼라를 가진 바이러스의 끝이 두개골의 수준에 있을 때 그 좌표에 0은 천천히 주입 측의 가장 낮은 위치로 시추공으로 낮춥니다. 반월 상 연골이 낮아질 때까지 주사기로 소량의 양압을 적용하십시오. 유리 캐뉼라를 다음 위치로 위로 이동하기 전에 바이러스가 2~ 3분 동안 확산됩니다.
유리 캐뉼라를 매우 천천히 제거하고 최종 주입 후 폐기하십시오. 이제 이식을 위해 두개골을 준비합니다. 압축 공기로 두개골을 건조,이 해당 스틱프라이머를 적용하고 15 초 동안 건조하게.
동일한 스틱으로 결합을 적용하고 UV 빛으로 20 초 동안 치료하십시오. 임플란트를 해당 홀더에 넣고 유리 섬유의 끝을 시추공 바로 위에 배치하고 조심스럽게 하급합니다. 수퍼글루의 나머지 판막이 두개골에 닿으면 임플란트를 낮추는 것을 중단하십시오.
광섬유의 이식은 또한 해마와 같은 양자 구조물을 위해 만들어질 수 있습니다. 이를 통해 두 반구모두에서 동시에 약간의 자극을 주거나 두 개의 서로 다른 구조를 자극할 수 있습니다. 또한 광섬유 임플란트와 다른 위치에서 바이러스를 주입할 수도 있다.
사출 및 이식이 다른 지역에서 수행되는 경우, 인산을 적용 한 후 그러나 두 성분 접착 전에 필요한 모든 구멍을 드릴. 두개골이 여전히 완전히 건조한지 다시 확인한 다음 임플란트 주변과 주변 지역에서 유체 치과 시멘트를 적용한 다음 UV 빛으로 20 초 동안 치료하면 완전히 털이 없고 말린 두개골 부위에 두 개의 더 적은 시멘트를 적용하십시오. 자외선으로 모든 층을 치료합니다.
수술을 마치려면 전체 상처에 요오드 주석을 적용합니다. 코와 귀 고정을 해제하고 마우스를 신선한 케이지에 넣고 체온손실을 피하기 위해 가열 램프 아래에 놓습니다. 적어도 하루에 한 번 건강 상태를 확인하고 필요한 경우 3 일 후에 수술 과 대수 후 퇴역합니다.
2 주 간의 회복 후, 마우스는 행동 실험에 사용할 수 있습니다. 펄스 소프트웨어소프트웨어를 열고 광원이 연결된 USB com 포트를 선택합니다. 외부 소프트웨어가 광원을 제어할 수 있도록 작동 모드 3을 선택합니다.
5밀리초 광 펄스로 20 헤르츠 자극에 대한 올바른 조정을 선택합니다. 펄스와 통신할 분할을 찾으려면 시작 시퀀스를 누릅니다. 이 상태는 실험이 완료될 때까지 유지됩니다.
이제 EthoVision XT에서 새 실험을 만들고, 파일로 이동하고, 템플릿에서 새 를 선택하고 미리 정의된 템플릿을 선택합니다. 라이브 트래킹을 선택하고 소스로 카메라를 선택하고 연결된 Puslar Gen-Eye 캠을 확인합니다. 기록해야 하는 동물로 마우스를 선택합니다.
아레나 템플릿, 열린 필드 사각형 및 영역 템플릿 센터, 테두리, 모서리를 선택합니다. 추적해야 하는 하나의 피사체를 확인하고 중심점, 코점 및 꼬리 베이스를 선택합니다. 배경에 비해 동물의 색이 어둡고 단계를 완료하는 데 권장되는 샘플 속도를 확인합니다.
실험의 이름을 적절히 지정하고 저장할 위치를 선택합니다. 경기장 설정을 찾을 때까지 카메라가 자동으로 배경 이미지를 엽니다. 미리 정의된 영역을 화살표와 오른쪽에 있는 두 개의 기호를 사용하여 실제 영역에 적응합니다.
일부 영역이 필요하지 않으면 삭제합니다. 그리기 스케일을 눌러 미로의 한 구석에서 다른 쪽 구석으로 선을 정립합니다. 센티미터에 실제 거리의 길이를 입력합니다.
다른 축에 대해 반복합니다. 평가판 제어 설정을 정의하려면 조건 시간을 20분으로 조정하여 기본 규칙을 준비합니다. 스타 트렉의 조건은 피사체가 경기장에 있을 때 2초 동안 경기장에 있을 때 마우스가 경기장에 있을 때 추적의 자동 상태를 위해 해야 합니다.
라이트 자극에 대한 하위 규칙을 만들려면 구조로 이동하여 하위 규칙을 선택합니다. 기본 규칙 아래에 놓고 두 상자를 분산시보세요. 조건에 가서, 시간을 주고 하나에 빛같은 이름을 주고, 조건을 조정하면 5 분 후에 충족됩니다.
하위 규칙의 시작 상자 뒤에 상자를 직접 놓습니다. 사용자 지정 하드웨어를 사용하여 하나의 조명으로 이름을 지정합니다. 수행 할 작업을 선택 : 나는 하나를 높게 넣어 것입니다.
상자를 조건 상자 바로 뒤에 놓습니다. 스텝을 반복하여 빛을 가볍게 프로그래밍합니다. 이제 구조, 하위 규칙 참조로 이동하여 참조가 올바른 하위 규칙에 속하는지 확인합니다.
시작 조건에 따라 지체 없이 시작 조건을 선택하고 시작 조건에 따라 한 번 실행되는 상태로 시작하는 조건을 선택합니다. 참조 상자를 추가 책 1권과 조건 부 책 두 가지 주요 규칙 사이에 놓습니다. 이제 감지 설정을 정의하여 시스템에서 추적할 내용을 표시합니다.
테스트 마일을 경기장에 배치하고 자동화된 설정을 선택합니다. 설치류를 동물 유형으로 선택하고 마우스 커서를 사용하여 경기장에서 마우스 주위에 상자를 그립니다. 예로 치료 질문의 결과를 확인합니다.
오픈 필드 실험의 경우 실험 용 마우스를 실험 직전에 행동실에 가져와 적절한 수준의 불안을 보장하십시오. 마우스를 케이지의 격자에 부드럽게 눌러 광원의 슬릿이 될 수 있습니다. 10분 동안 신선한 쓰레기가 있는 대기 케이지에 넣고 라이트 케이블에 적응합니다.
정지 버튼을 눌러 인수를 시작하고 XT를 비전합니다. 대기 케이지에서 마우스를 열린 필드의 왼쪽 상단 모서리로 옮습니다. 실험 중에 마우스의 시야를 그대로 두고 침착하게 하십시오. 20분 후 실험이 끝나면 미로에서 마우스를 제거하고 라이트 케이블을 분리하여 자체 케이지에 다시 넣습니다.
검사 시각화를 통해 라이트 오프와 얼굴의 라이트 사이의 중심 시간의 차이를 직접 볼 수 있습니다. 마우스는 빛이 켜져 있을 때 중앙에서 보내는 시간을 줄입니다. 반즈 미로 실험의 경우, 실험 1시간 전에 모든 실험마우스를 행동실에 넣습니다.
반즈 미로를 제외한 모든 구멍을 닫고 이제 이스케이프 박스가 놓여 있는 것을 준비한다. 임플란트의 광원에 마우스 한 개를 연결하고 반즈 미로 의 중간에 직접 놓습니다. 시작 을 누르고 다음 T를 방문하고 판지 상자를 제거해야합니다.
소프트웨어가 전체 전환을 인식하지 못하는 경우에 대비하여 수동으로 평가판을 중지할 준비를 하십시오. 미로에서 마우스를 꺼내 라이트 케이블에 대한 연결을 제거합니다. 수행, 학습 및 메모리 작업을 수행할 때 조작의 즉각적인 효과뿐만 아니라 획득, 통합 또는 검색 중에 조작의 장기적인 효과를 조사합니다.
데이터 분석을 위해 치료 또는 제어된 치료 조건을 찾고 중첩으로 이동하여 예심 제어 상태를 선택합니다. 요소 액션 스타 트렉에서 요소 액션 라이트가 하나에 가는 상태 간격을 선택합니다. 중첩 상자를 필터 상자 처리와 해당 결과 상자 사이에 배치합니다.
이 정의된 간격은 하나입니다. 대조군과 마찬가지로 두 개 중 하나와 둘 에 간격에 대한 단계를 반복합니다. 또한 분석 프로파일에서 분석할 매개 변수를 정의합니다.
영역에서 종속 변수를 선택하고 영역 중심, 본문 점, 중심점을 선택하고 평가판 통계를 선택합니다. 주파수, 누적 지속 시간을 선택하고 첫 번째 를 볼 수 있습니다. 또한 거리 이동을 변수로 추가합니다.
이 프로필을 사용하면 중앙, 센터 항목 및 거리 이동에 소요되는 시간에 대한 데이터를 사용할 수 있습니다. 각 부서에서 데이터를 추출하려면 결과로 이동하여 통계 및 차트를 선택하려면 계산을 눌러 분석된 데이터를 확인합니다. 내보내기 데이터를 누르고 평가판 통계와 저장할 위치를 선택합니다.
내보낸 데이터는 엑셀 파일로 저장되며 모든 마우스에 대한 개별 값입니다. 또한, 열지도 시각화및 플롯 히트 맵을 눌러, 모든 마우스와 평가판에 대한 개별 열지도를 볼 수있는 오른쪽에 시험을 선택합니다. 마우스를 마우스오른쪽 으로 클릭하고 열지도를 이미지로 내보냅니다.
나중에, 엑셀 파일을 컴퓨터를 열고 네 가지 시험과 모든 측정 된 컨디셔닝 그룹에 대한 평균 및 표준 유로 SCM을 계산합니다. 그래프와 시그마 플롯을 생성하려면 수단과 SCM을 추가 파일에서 시그마 플롯에 올바른 순서로 복사합니다. 행은 하나 에서 하나에 대한 데이터를 포함해야하며 열에는 평가판, 평균 및 SCM hertz가 포함되어 있습니다.
세 열을 모두 선택하고 그래프를 작성합니다. 막대 상자를 선택하고 화살표로 그룹화되지 않은 상자를 선택합니다. 전체 그래프에 레이블을 지정하고 집으로 이동하여 그래프 상자를 선택하고 내보내기를 누릅니다.
대상 폴더를 선택하고 메타 파일을 형식으로 선택합니다. 획득된 데이터에 대한 통계를 계산하려면 Xcel에서 오른쪽 데이터를 하나, 등 세테라 및 시그마 플롯의 단일 열에 복사합니다. 비교할 열을 표시하고 분석으로 이동하여 T 테스트 및 실행 중기를 선택합니다.
마지막으로, 행동 데이터는 추가 히트 맵 전문화로 해제 및 시험판에 나눌 수 있습니다. 오픈 필드 실험에서, Channelrhodopsin2 및 피라미드 뉴런의 빛 자극 도중, 센터 기간은 감소합니다, 증가된 불안 수준을 나타내는. 면역히스토케를 통해, 바이러스의 주사 부위 및 발현이 결정될 수 있으며, 또한 특수 Cre-의존하는 마우스 라인의 특이성에서도 검증될 수 있다.
하나는 명확하게 Channelrhodopsin2의 빛 자극이 특정 피질 지역의 마음 뉴런을 향상 불안 수준을 증가 것을 볼 수 있습니다, 그 자극 전에 기준선 불안에 비해. 행동에 조작의 이 즉각적인 효력은 편유전학이 행동에 관하여 이렇게 많은 연구 질문에 오늘 이용되는 이유입니다. 이 절차는 마우스 두뇌에 있는 어떤 원하는 세포 모형 또는 신경 회로의 Optogenetic 변조를 위해 이용될 수 있습니다.
이 절차를 연구에 적합한 행동 테스트와 결합함으로써 행동과 관심 있는 질병에 관련된 신경 회로에 대한 심층적인 통찰력을 얻을 수 있습니다.
