현재의 프로토콜은 숙련 된 운동 행동의 기초가되는 뇌 메커니즘의 연구에 기여합니다. 무선 광유전학은 피험자가 자유로운 움직임으로 작업을 수행하는 동안 특정 뉴런의 조작을 허용합니다. 고속 비디오 그래피와 결합하여 미세 운동 거동에 대한 상세한 분석을 할 수 있습니다.
이 방법은 신경 발달 및 신경 퇴행성 장애의 운동 문제를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 기술은 다른 행동 패러다임에서도 뇌 기능을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 내 실험실의 학부생 인 Diana Rodriguez-Munoz는 실험을 도울 것입니다.
수술 절차의 경우, 관심 구조의 등쪽 - 복부 좌표에 따라 원하는 길이의 LED 캐뉼라를 준비하여 시작하십시오. 이렇게하려면 유리 섬유를 최종 원하는 크기보다 긴 길이로 자르고 거친 사포로 섬유 팁을 목표 길이로 연마하십시오. 그런 다음 섬유 팁을 미세한 사포로 닦으십시오.
미세 주사의 경우 피펫에 미네랄 오일을 채우고 피펫을 마이크로 인젝터에 넣으십시오. 일부 미네랄 오일을 주입하여 마이크로 인젝터가 올바르게 작동하는지 확인하십시오. 다음으로, 안과 연고를 바르고 트리머 및 제모 크림으로 두피에서 모발을 제거하여 수술을 위한 마취된 마우스를 준비한다.
그런 다음 8 % 포비돈 요오드와 70 % 에탄올을 각각 세 번 번갈아 가며 면봉으로 두피를 닦으십시오. 소독 후 마우스를 입체 택시 장치에 넣고 머리를 고정하여 두개골이 내측 및 전후 축에 수평을 이루도록하십시오. 메스를 사용하여 시상 축을 따라 눈 높이에서 두피를 통해 한 센티미터 절개를하십시오.
그런 다음 피부를 수축시켜 두개골을 노출시키고 면봉으로 골막을 닦으십시오. 식염수와 면봉으로 두개골 표면을 청소하고 멸균 흡수성 눈 창을 사용하여 표면의 출혈을 해결하십시오. 그런 다음 면봉에 2.5 % 과산화수소를 떨어 뜨리고 몇 초 동안 작용하여 두개골 봉합사를 볼 수있게하고 더 나은 참조를 얻으십시오.
몇 초 후, 깨끗한 면봉으로 그 지역을 깨끗이 닦으십시오. 최종 팁 직경이 15미크론인 유리 피펫으로 브레그마와 람다를 찾아 두개골이 전후축에 수평을 이루고 있는지 확인합니다. 그런 다음 마커를 사용하여 선택한 좌표 위의 두피에 참조점을 페인트합니다.
기준점에서, 작고 둥근 치과 드릴 비트로 저속 내지 중속으로 회전 공구로 두개골에 부드러운 압력을 가하는 1 밀리미터 직경의 두개골 절제술을 수행하십시오. 완료되면 모세관을 선택한 전후 또는 AP쪽으로 이동하고 내측 또는 ML 좌표를 이동합니다. 관심 영역에서 채널로돕신을 발현하기 위해 300 내지 400 나노리터의 CreE 의존성 아데노-관련 바이러스, 또는 AAV와 같은 AAV1, D-플록스 채널로돕신 mCherry로 모세관을 로딩한다.
AAV는 리포터 단백질을 발현시키기 위한 대조군으로서 사용될 수 있다. 팁이 막히지 않도록 한 후 등쪽 - 복부에서 3.35 밀리미터 좌표를 뺀 등쪽 선조체에서 뇌에 유리 피펫을 도입하고 자동 인젝터를 사용하여 초당 23 나노 리터의 속도로 200 나노 리터의 바이러스를 주입하십시오. 유출을 피하기 위해 유리 피펫을 천천히 꺼내기 전에 주사 후 10 분 동안 기다리십시오.
그런 다음 면봉으로 잔류 물을 청소하고 말리십시오. 다음으로, 유리 LED 캐뉼라를 입체 택시 암에 부착하고 bregma를 참조로 사용하여 좌표를 보정합니다. 그런 다음 캐뉼러를 천천히 삽입하여 조직 손상을 피하고 주사 부위 위에 100 마이크로 미터 위에 놓습니다.
LED 캐뉼라가 제자리에 놓이면 두개골 절제술의 가장자리에 100 마이크로 리터의 조직 접착제를 떨어 뜨립니다. 멸균 브러시를 사용하여 갓 준비한 치과 시멘트 혼합물을 캐뉼라 커넥터 주위에 조금씩 적용하고 두개골이 덮히고 커넥터가 두개골에 단단히 부착되어 핀이 완전히 자유로워 질 때까지 층을 만듭니다. 시멘트가 완전히 건조되면 조직 접착제를 사용하여 임플란트 주위의 피부를 닫으십시오.
그런 다음 마우스를 섭씨 33도의 가열 패드 위에 회복 케이지에 놓고 불편 함이나 통증의 징후를 모니터링하십시오. 일반 카메라로 동물의 행동을 기록하고 챔버 앞쪽에서 초당 30 ~ 60 프레임을 캡처하십시오. 거울은 동물의 자세를 모니터링하기 위해 45도 각도로 훈련실 아래에 놓을 수 있습니다.
마우스가 펠릿에 도달하기 시작할 때, LED 캐뉼라를 리모컨으로 수동으로 돌려 거동이 두 초 이상 수행되지 않는 시간 동안 연속적인 자극을 갖도록 한다. 자극 장치는 밀리미터 평방 당 하나의 밀리와트의 끝에서 강도로 470 나노 미터의 LED를 트리거합니다. 광유전 적 조작하에 동물의 미세한 운동 행동은 도달 - 파악 과제로 연구되었습니다.
마우스는 며칠 만에 작업을 수행하는 법을 배웠고 55 % 이상의 정확도를 달성하여 5 일간의 훈련 후에 고원에 도달했습니다. 움직임의 궤적은 고속 비디오 그래피로 추적되어 운동학을 분석 할 수있었습니다. 이동 거리, 속도, 가속도, 종점 및 궤적과 같은 매개 변수에 대한 정량화 가능한 평가가 수행되었습니다.
놓친 시험에서, 마우스는 히트 시험보다 펠릿에서 더 멀리 떨어져있는 잡기 운동을 시작했습니다. 또한, 오류는 마우스 자세와 상당히 관련이 있었으며, 타격 중 신체 각도의 차이와 놓친 시험으로 나타났습니다. 스파이니 프로젝션 뉴런 또는 SPN을 발현하는 D1 도파민의 대측성 활성화는 대조군 조건에 비해 파악 성공을 감소시켰다.
광유전학적 자극 동안, 발 궤적은 이동 거리에서 증가하여, 펠릿을 표적으로 할 수 없는 무능력과 초기 오차 유형의 증가로 이어졌다. 원리 성분 분석, 또는 PCA는 대측성 D1 SPNs 활성화 동안 모든 시험 궤적이 대조군 클러스터와 거의 겹치지 않는 클러스터에서 분리되는 것을 보여주었고, 이는 낮은 유사성을 나타낸다. 동측 측에서 DSPNs의 활성화는 PCA 분석에 의해 나타난 궤적 분산의 증가를 가져왔다.
따라서 동측성 D1 SPNs 활성화는 행동 결과를 변경하지 않고 도달 궤적을 수정했습니다. 이 프로토콜을 수행 할 때 캐뉼라를 올바르게 배치하여 훈련 세션 중에 분리되지 않도록주의하십시오. 이 방법은 다른 행동 패러다임에서 운동 행동, 감각 처리, 학습 및 기억을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
무선 광유전학은 진정으로 자유롭게 움직이는 피험자에서 자연 주의적 행동과 신경 생물학적 토대를 연구 할 수있게 해줍니다.
