이 프로토콜은 다른 중추 신경계 지역 간의 미세 혈관 분기뿐만 아니라 다른 개인 들 사이의 비교를 허용하기 때문에 중요합니다. 이 마이크로선박 분리 기술은 하루 내에 완료될 수 있으며, 초원심 분리 및 효소 해리의 필요성을 제거합니다. 수막과 치로이드 신경을 제거하는 것은 어려울 수 있습니다.
각 조직의 완전한 제거를 보장하기 위해 천천히 신중하게 작동해야합니다. 작은 lissencephalic 척추 동물 견본에서 CNS 조직 해부를 위해, 얼음에 MV-1 용액을 포함하는 15 밀리리터 원추형 관에 수확한 두뇌를 놓고, 두개골의 셀라 turcica에서 뇌하수체를 회수하기 위하여 집모를 이용하십시오. 뇌하수체를 MV-1 용액의 1.7 밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 얼음에 놓고 피부와 근육을 제거하여 척추 컬럼을 노출시합니다.
사지, 흉곽 및 내부 장기를 제거 한 후, 18 게이지 바늘이 장착 된 10 밀리리터 주사기를 사용하여 요추 척추 포먼 전체에 걸쳐 코달 - 투 - 로스트랄 방향으로 신선한 MV-1 용액으로 척추 컬럼을 플러시하십시오. 그런 다음 척수를 신선한 MV-1 용액을 포함하는 5 밀리리터 튜브에 놓습니다. 다음으로, 해부 현미경 의 밑에 페트리 접시에 두뇌를 놓고, 이중 갈래 찌르기로 수막을 제거합니다.
수막 조각이 남아 있지 않도록 척수를 확인하십시오. 시상 하 부, 소뇌, 뇌 줄기 및 피 질을 분리 하는 집게를 사용 하 여. 필요한 경우, 후각 전구와 시동을 소비하기 위해 집게와 홍채와 봄 가위를 사용하고, 모든 뇌 심실에서 모든 choroid 신경을 제거하기 위해 이중 갈래 찌르기 찌르기를 사용합니다.
큰 자임내막 척추 동물 견본에서 CNS 조직 해부를 위해, 해부현미경 및 이중 갈래 찌르기, 집게, 홍채 및 봄 가위를 사용하여 각 CNS 조직에서 수막을 제거하고, 뇌 심실에서 choroid 신경질의 조각을 제거하는 주의하십시오. 수확된 CNS 조직의 균질화를 위해 각 CNS 영역을 개별 페트리 요리 내에서 1~2밀리미터 조각으로 다진다. 작은 척추 동물 표본에서 CNS 조직을 균질화하기 위해, MV-1 용액의 1 밀리리터를 추가하여 다진 조직을 중단하는 이송 파이펫을 사용합니다.
그런 다음 동일한 이송 파이펫을 사용하여 피질, 소뇌, 뇌줄기, 광학 엽 및 척수 조각을 개별 10 밀리리터 유리 조직 분쇄기로 분배하고 PTFE 유봉과 MV-1 용액 5개를 사용하여 각 조직 세트를 약 10스트로크로 분쇄합니다. 각 조직 슬러리를 얼음 위에 개별 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮기고, 집게를 사용하여 개별 1.7 밀리리터 튜브에 MV-1 용액의 100 마이크로리터에 시상 하부 및 뇌하수체를 배치합니다. 그런 다음 유리 마이크로 페슬로 각 조직을 조심스럽게 균질화합니다.
큰 척추 동물 표본을 균질화하려면, 55 밀리리터 유리 조직 분쇄기로 다진 조직을 전송하기 위해 beveled 컷 전송 파이펫을 사용하고, 오버 헤드 교반기에 분쇄기를 부착. 표에 표시된 대로 균질화되는 특정 CNS 부분에 따라 MV-1 용액의 권장 량의 절반을 추가하고 오버헤드 교반기를 분당 약 150회전으로 켭니다. 유리 튜브를 약 30초 동안 위아래로 움직여 오버헤드 교반기를 끄고 균일한 슬러리가 얻어질 때까지 추가균질화를 위해 MV-1 용액을 더 추가합니다.
그런 다음 균질화 된 조직을 얼음에 50 밀리리터 원판 튜브로 옮기십시오. 마이크로 용기 정화를 위해, CNS 조직은 원심분리에 의해 균질화하고, 초월제를 폐기한다. 작은 척추 동물 표본 마이크로 선박 절연의 경우, 피질, 소뇌, 뇌 줄기, 광학 엽 및 척수 펠릿을 피펫, 샘플 당 신선한 얼음 차가운 MV-2 용액 5 밀리리터에서 약 10 번, 각 튜브에 얼음 차가운 MV-2 용액 5 밀리리터를 추가합니다.
조심스럽게 혼합 튜브를 플립, MV-2 용액의 한 밀리리터에서 시상 하부 및 뇌하수체 펠릿을 다시 중단. 큰 척추 동물 표본 마이크로 혈관 절연의 경우, 피질, 소뇌, 뇌 줄기 및 척수 미세 혈관 펠릿에 얼음 차가운 MV-2 용액 20 밀리리터를 추가하고 약 5 분 동안 분당 40 회전에서 튜브 리볼버에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 재서스펜션의 끝에서, CNS 조직이 원심분리에 의해 리케이트를 분리하고, 각 튜브를 천천히 회전하여 상퍼가 벽을 따라 통과하여 관 벽에서 액체 인터페이스의 두껍고 조밀한 골수진 층을 조심스럽게 분리합니다.
골수와 액체 인터페이스를 버리고 각 튜브의 내부 벽을 낮은 보풀 종이 닦아 주걱으로 얼룩. 그런 다음 꼬인 로우 린트 종이 닦기를 사용하여 과도한 액체를 흡수하고 바인딩이 적은 팁을 사용하여 각 펠릿을 MV-3 용액 1밀리리터로 다시 일시 중단합니다. 마이크로용기 용출 및 여과의 경우, 각 CNS 조직 마이크로용기 슬러리에 신선한 MV-3 용액을 몇 밀리리터를 혼합하고, 골재를 피하기 위해 혼합하는 동안, 각 서스펜션을 프루이트 스트레이너를 통해 개별 50 밀리리터 원내 튜브로 변형한다.
CNS 영역당 20 마이크로미터 나일론 그물 필터 하나를 하나의 수정된 필터 홀더에 놓습니다. 필터 홀더를 50밀리리터 원추형 튜브로 옮기고, 5밀리리터의 얼음-차가운 MV-3 용액으로 필터를 적시어 버퍼가 필터 홀더아래로 부어 원추형 튜브에 넣습니다. 각 20 마이크로미터 나일론 그물 필터에 용출 된 마이크로 혈관을 전송하고, 얼음 차가운 MV-3 용액의 5 ~ 10 밀리리터로 마이크로 혈관을 헹구는.
집게를 사용하여 각 필터를 얼음-차가운 MV-3 용액이 들어 있는 개별 비커로 옮기고 각 필터를 약 30초 동안 부드럽게 흔들어 미세 혈관을 분리합니다. 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮긴 후 원심분리로 마이크로용기를 수집하고, 저결합 파이펫을 사용하여 얼음-차가운 MV-3 용액 1밀리리터로 각 펠릿을 다시 중단합니다. 그런 다음, 작은 척추 동물 표본에서 마이크로 선박 현탁액을 섭씨 4도에서 20, 000 배 G에서 5 분 동안 원심 분리를위한 1.7 밀리리터 미세 원심 분리 튜브로 이송합니다.
큰 척추 동물 표본의 경우 서스펜션을 개별 5 밀리리터 원심분리 튜브로 옮기고 4°C에서 2, 000배 G에서 5분간 원심분리용 MV-3 용액 4밀리리터를 추가합니다. 신경혈관 부의 본질적인 성분은 CD31, PDGFR 베타 및 아쿠아포린 4에 대한 면역 라벨링에 의해 입증된 바와 같이 마이크로혈관 내에서 검출될 수 있으며, 피질, 소뇌, 뇌하부항, 뇌줄기 및 척추 미세혈관을 포함한다. 마찬가지로, 부착-접합 단백질 VE-cadherin, 단단한 접합 단백질 CLDN5 및 조눌라 옥클루덴스-1, 삼세포 접합 단백질 angulin-1, 및 기저 마크 케모킨 리간드 CXCL 모티프 12, 감마 글루타밀 트랜스퍼라제-1의 발현이 시각화될 수 있다.
더욱이, 마이크로혈관의 대다수는 알파 평활근 액틴의 발현이 결여되어 있으며, 이는 이러한 격리 프로토콜이 선택적으로 작은 구경 마이크로선을 표적으로 한다는 것을 나타낸다. 조류, 거짓말쟁이, 개구리 및 물고기와 같은 다른 작은 lissencephalic 척추 동물에서 얻은 미생물은 이 방법이 종 사이의 신경 혈관 단위의 차이의 추가 특성화에 유용하다는 것을 시사하는 몇 가지 형태학적 특징을 공유합니다. 단백질 발현의 변화의 정량화는 실험적인 자가면역 뇌척수염의 피크 동안 척수 미세혈관을 따라 혈관 세포 접착 분자 1개 및 접합 접착 분자 B의 증가를 나타낸다.
그러나, 혈관 세포 접착 분자 하나는 또한 뇌하수체 미세 혈관에서 현저하게 증가하고, 시상 하부 및 뇌간 미세 혈관에서 감소한다. 또한, 모든 CNS 조직에서 만성 실험자가 면역 뇌척수염 동안 혈관 세포 접착 분자 1발식, 그리고 시상하부 및 뇌하부 미생물에서 접합 접착 분자 B 발현에서 변화가 관찰된다. 서양 얼룩, PCR 및 면역 조직 화학과 같은 정량적 분석은 이 절차에 따라 수행되어 혈액-뇌 장벽 내의 유전자 및 단백질 발현 패턴에 대한 통찰력을 나타낼 수 있습니다.
파라포름알데히드는 급성 독성 시약이며, 적절한 PPE를 착용하는 동안 항상 연기 후드 에서 처리해야합니다.
