많은 임신은 7 개 또는 8 후 수정 의 주위에 인간 적인 태아 발달에서 일찌기 실패합니다. 이 프로토콜은 이 신비한 이식 기간 동안 시험관에서 인간 개념가를 성장시킬 수 있는 기회를 연구원에게 제공합니다. 이것은 우리가 인간 이식및 초기 태반 대형의 성공을 뒷받침하는 기계장치를 이해할 수 있게 합니다.
생체 외에서 peri 이식 단계를 성장하기 위해 확장 된 배양 시스템을 사용하는 것은 아마도 이식 및 초기 트로피후블라스트 분화를 연구하기 위해 본격적인 재료를 얻을 수있는 유일한 방법입니다. 이 간단한 기술은 인간의 초기 개발에 대한 많은 근본적인 질문에 대답 할 수있는 강력한 도구입니다. 이 프로토콜의 사용으로 수행 된 연구는 주로 초기 임신 손실, 재발 이식 실패 및 태반 병리의 이해에 기여할 것입니다.
절차를 시연하는 것은 실험실에서 박사 과정 학생인 Deirdre Logsdon이 될 것입니다. 배아 온난화 하루 전에 멸균 라미나르 플로우 후드로 미디어 및 복구 플레이트를 준비합니다. BM 500 마이크로리터로 2개의 센터 잘 장기 배양 세척 접시를 10%SPS로 채운 다음 BM을 배아 배양 등급 오일 500마이크로리터로 커버합니다.
16mm 조직 배양 접시에서, 배아 배양 오일의 8 밀리리터를 층과 바닥에 10%SPS와 BM의 20 마이크로 리터 방울을 앵커. 37섭씨, 이산화탄소 6%, 산소 5%를 4시간 이상 인큐베이터에 보관합니다. Aliquot 는 IVC 1의 약 4 밀리리터를 5 밀리리터 스냅 캡 튜브에 넣고 오일 오버레이 없이 IVC 1의 500 마이크로리터로 한 개의 세척 접시를 준비합니다.
인큐베이터의 접시와 튜브를 적어도 4시간 동안 평형화합니다. PBS의 인간 혈청에서 밀리리터당 30 마이크로그램으로 섬유넥틴을 희석시킵니다. 우물을 만지지 않도록 주의하는 8 개의 잘 챔버 커버 슬립 패키지를 열고 각 우물에 섬유 네틴의 250 마이크로 리터를 부드럽게 피펫하십시오.
커버슬립의 뚜껑을 교체하고 섭씨 4도에서 20~24시간 동안 배양합니다. 배아 온난화의 아침에 확장 된 배양 판을 준비합니다. 챔버 커버 슬립을 fibronectin으로 검색하고 라미나르 플로우 후드에 놓습니다.
그런 다음 1 밀리리터 파이펫으로 섬유네틴 혼합물을 제거하고 폐기하십시오. 피펫 300 마이크로리터의 EVC 1을 각 우물에 넣고 표지 슬립을 인큐베이터에 넣고 조나 펠루치다를 제거할 때까지 인큐베이터에 넣습니다. D5 인간 배아의 온난화와 회복 후, 재확장을 위해 평가하고 각 배아의 사진을 찍습니다.
각 배아를 5%FCS로 MOPS 버퍼처리 매체의 500마이크로리터로 이동합니다. 그런 다음 텍스트 원고에 설명된 대로 산성 Tyrode의 용액으로 처리합니다. 용해 구역으로 배아를 300 마이크로리터로 즉시 이동하여 티로데의 용액을 담금질합니다.
그런 다음 배아 배양 등급 오일하에서 10%SPS로 평형 BM을 함유하는 중앙 웰 장기 조직 접시로 배아를 이동한다. 그런 다음 배아를 20 마이크로리터 회복 드롭으로 되돌려 놓습니다. 개별적으로 계형IVC 1 매체를 사용하여 배아를 세척 접시로 옮은 다음 각 배아를 챔버 커버슬립의 우물로 조심스럽게 이동하여 배아 식별을 추적합니다.
챔버 커버슬립을 섭씨 37도, 이산화탄소 6%, 대기산소로 설정된 인큐베이터로 2일 간 반납한다. 2일째되는 날, 현미경으로 배아의 부착을 주의 깊게 살펴보고 미디어를 교환한다. 접시를 부드럽게 눌러 접시에 부착되는 배아를 알 수 있습니다.
미디어를 변경하려면 뚜껑을 제거하고 IVC 1의 150 마이크로리터를 조심스럽게 흡인하여 부착된 배아를 방해하지 않도록 주의하십시오. 배아가 아직 접시에 부착되지 않은 경우 IVC 1의 혈청이 부착에 도움이 되기 때문에 미디어를 교환하지 마십시오. 평형 확장 배양 매체의 150 마이크로리터를 천천히 피펫, IVC 2는 각 우물에 넣고 커버슬립의 뚜껑을 교체합니다.
조심스럽게 챔버 커버 슬립을 인큐베이터로 돌려보냈다. 배아가 고정 또는 단세포 소화를 위한 준비가 될 때까지 매일 미디어 교환 및 첨부 검사를 반복합니다. 추가 분석을 위해 소비된 미디어의 수집이 필요한 경우, 스냅제거된 IVC 1의 150마이크로리터를 멸균 저구속 0.5 밀리리터 튜브로 동결한다.
PBS의 200 마이크로 리터로 각 배아를 한 번 씻은 다음 각 우물에 트립신 용액 200 마이크로 리터를 추가하십시오. 챔버 커버슬립을 인큐베이터에 5분간 반납합니다. 작은 파이펫이나 잘게 당겨진 입 파이펫을 사용하여 개별 MTB를 수령한 다음 더 큰 파이펫을 사용하여 배아를 위아래로 부드럽게 해리시합니다.
배아가 트립신에서 총 10분 동안 배양될 때까지 더 작은 직경의 파이펫 팁을 사용하여 배아를 부드럽게 그리고 반복적으로 흡입합니다. 단일 세포 선택을 수행하기 위해, 접합 된 세포를 통해 320 마이크로 리터 세척 방울및 배아 배양 오일에서 0.1 %의 PVP를 이동하여 세포를 잃지 않도록주의하십시오. 세포를 세척한 후 잘게 당겨진 유리 파이펫을 사용하여 하나의 셀을 선택합니다.
PBS및 PVP의 최소 부피와 멸균 0.2 밀리리터 낮은 바인드 튜브에 단일 셀을 조심스럽게 피펫. 액체 질소에 무료 단일 세포를 스냅 하 고 추가 사용을 위해 부정적인 80 섭씨에 저장. 건강한 배아는 확장된 문화의 과정을 통해 지속적인 증식을 보였고, 비정상적인 배아는 바깥쪽 가장자리에서 후퇴하고 분해되기 시작했습니다.
8일째 에 수정, 배아에 있는 대부분의 세포는 사이토트로포블라스트 또는 CTBs, 그 trophoblast 마커 GATA-3에 대 한 긍정적인. 배아의 주변에서 CTB는 이미 외모와 같은 시트를 가지고 인간 CGB에 대한 양성 얼룩이있는 다중 핵 싱크티오트로포블라스트로 분화했습니다. 10일째, CGB 양성 철새 대열 세포의 형성은 최대였고, 이는 현재 HCG 생산의 급증에 의해 확인되었다.
HLA-G에 대 한 긍정적인 염색 철새 trophoblasts, 또한 등장 하 고 배아 몸에서 멀리 이동 하기 시작. 12일째까지 STB 분화는 감소하고 MTB 생산이 더욱 두드러졌으며, 10일째에 호르몬 생산에서 세포 이동으로 12일째에 중점을 두는 것을 시사했습니다. 이러한 변화는 페리 이식 기간의 시간 경과 비디오에서 관찰될 수 있다.
비디오는 blastocele의 붕괴, STB의 형성 및 MTB의 최종 분화 및 마이그레이션을 보여줍니다. 이 절차를 완료할 때 명심해야 할 가장 중요한 것은 온도, 진동 및 pH의 변화에 민감한 살아있는 배아와 함께 작업하고 있다는 것입니다. 배아가 배아 건강 상태를 유지하는 데 중요한 배식기에서 나오는 시간을 최소화하는 것이 중요합니다.
이 절차를 완료한 후, 조사자들은 단세포 RNA 염기서열 분석 및 전체 게놈 편심염 시퀀싱과 같은 하류 단일 세포 오믹스 분석법에 대해 격리된 단일 세포를 사용하여 인간 이식 및 초기 태반 형성 중 후생유전학 및 전사적 변화를 더 잘 이해할 수 있다.
