식물 병원균 검출은 식물 성 질병 관리에 중요한 단계입니다. 이 프로토콜은 일반적인 수인성 전투기 병원균으로 인한 관개 수질 오염을 위한 신속한 검출 방법을 제공한다. 이 기술을 사용하여, Phytophthora capcici와 같은 특정 병원체는 현장에 남아있는 동안 관개 물의 우리의 큰 양에서 처리되고 급속하게 검출될 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 오웬 허드슨, 내 실험실에서 석사 학생, 수미야 왈리울라, 박사 Pingxi G의 실험실에서 박사 후 연구원은 관개 물에 현장 Phytophthora capcici 검출을위한 펌프와 필터를 설정하는 것입니다. 핸드 펌프에 연결된 튜브에 여과 플라스크를 부착하고 여과 플라스크의 입에 고무 스토퍼에 부흐너 깔때기를 장착합니다. 그런 다음 15 미크론 고정 크기와 함께 적절한 크기의 필터 용지를 깔때기에 장착합니다.
물 샘플을 얻으려면 대상 소스에서 관개 수를 수집합니다. 물은 소량의 파편을 가질 수 있지만 상당한 퇴적물이나 토양은 없습니다. 수동 펌프를 사용하여 깔때기를 통해 물을 끌어 당기는 흡입을 만드는 동안 깔때기 내부의 필터 용지 위에 50 ~1000 밀리리터의 테스트 물을 천천히 붓습니다.
모든 물이 여과된 경우 집게를 사용하여 깔때기에서 필터 용지를 제거합니다. 그리고 멸균 가위를 사용하여 종이를 작은 조각으로 자른다. 실온에서 5분 동안 1.5 밀리리터 튜브에 추출 버퍼 400 마이크로리터에 8-12개의 종이를 담급합니다.
소용돌이 또는 그렇지 않으면 분당 10 초 동안 종이를 동요. 인큐베이션이 끝나면 집게를 사용하여 가능한 한 적은 버퍼로 용지를 제거합니다. 그리고 필터 종이 조각의 다음 세트와 라이센스를 반복합니다.
필터 종이 샘플에서 DNA 추출을 위해 단백질라제 K20 마이크로리터와 마이크로리터 RNA당 10나노그램의 마이크로리터를 샘플에 첨가하고 3분마다 소용돌이 또는 흔들림으로 실온에서 15분 동안 용액을 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 500 마이크로리터의 마그네틱 비드를 결합 버퍼에 넣고 시료에 넣고 흔들어 잘 섞는다. 실온에서 5분 후, 상체를 제거하고 폐기하기 전에 튜브와 마그네틱 분리기 랙을 2분간 놓습니다.
자기 분리기에서 튜브를 제거하고 500 마이크로리터의 세척 버퍼에서 구슬을 적극적으로 다시 중단하십시오. 30초 후에 튜브를 자석으로 돌려보내서 2분 정도 기다린 후 상체를 폐기합니다. 500 마이크로리터의 워시 버퍼와 80%에탄올의 500마이크로리터로 세척을 반복합니다.
그리고 공기는 실온에서 15 분 동안 자기 비드 펠릿을 구동합니다. 인큐베이션이 끝나면 1분 동안 파이펫팅을 사용하여 용출 버퍼 50 마이크로리터에서 구슬을 다시 정지한 후 2분 동안 튜브를 자석에 다시 배치하여 상골의 수집을 허용합니다. 테이블에 표시된 대로 LAMP 프라이머 믹스를 준비한 후, 추출된 DNA 1마이크로리터와 이중 증류수 9마이크로리터의 용암 램프 마스터믹스의 프라이머 믹스 12.5 마이크로리터를 PCR 튜브에 추가하고 1개의 양수 및 1개의 음수 대조군을 설정한다.
모든 샘플을 섭씨 64도 의 열 블로그에 45분 동안 배양하거나, 인큐베이션 끝에 있는 지니 3증폭기, 각 증폭된 시료의 5마이크로리터를 1%아가로즈 젤에 적재하고 자외선 이미징 기계에서 생성된 밴드를 이미지화한다. 칼로리 염료를 사용한 경우 색상 변경을 보고 결과를 양수 또는 음수로 결정합니다. 휴대용 증폭 기기를 사용한 경우 화면의 증폭 그래프를 보고 결과를 확인합니다.
64도에서 LAMP 분석을 실행하는 광학 시간은 45분이며, 검출에 긍정적이었던 가장 낮은 농도는 40분까지 증폭되지 않고 고농도는 20분으로 증폭됩니다. 증폭은 핵산 얼룩으로 표지된 1%아가로즈 젤에서 확인할 수 있다. 상시 상시 바와 같이 종래의 PCR은 LAMP보다 40배 덜 민감하다.
밀리리터 농도당 제3동물원에 4.8배 10배 의 검출 이 분석에서, 물 샘플은 Tift 카운티, 조지아에서 상업 야채 생산에 사용되는 일곱 연못에서 수집되었다. 그 중 3개는 긍정적인 램프 결과를 보여주었습니다.
그러나 기존의 PCR에 의해 샘플을 테스트했을 때, 동물원포기는 세 가지 양성 샘플 중 하나에서만 검출되었습니다. 이 표에서는 감도, 시간, 필수 준비, 재료 및 비용과 같은 변수를 사용하는 검출 방법의 차이점이 요약됩니다. LAMP는 테스트 된 방법 중 가장 비용이 많이 드는 방법이며, 또한 기존의 PCR 증폭에 비해 증폭을 위해 30 ~ 60 분만 필요로하는 가장 빠릅니다.
밀접하게 관련 된 UMI 종자 병원체에서 추출 된이 프로토콜 DNA를 사용 하 여 어떤 샘플에 대 한 검출 결과, 프라이머의 특이성을 확인. 오염을 제한하기 위해 LAMP 튜브에 추출 된 DNA를 추가 할 때 샘플 물을 너무 빨리 붓지 않도록하십시오. 다른 수인성 병원균이 특정 프라이머 세트를 개발한 후에는 여과 및 램프 산 방법을 다른 병원균에 맞게 조정할 수 있습니다.
