이 연구는 국방의과 대학의 보조금과 일본 보건복지부의 난치성 질병에 대한 연구를 위한 보건 노동과학 연구 보조금에 의해 지원되었습니다.

실험 프로토콜은 국방 의과 대학의 동물 연구위원회 (No. 16058)에 의해 승인되었다. 동물은 표준 실험실 차우 (CLEA Japan Inc., 도쿄, 일본)에 유지되었습니다. 실험실 동물은 건강의 국가 학회 지침에 따라 취급되었습니다.
1. 림프구의 수집 및 분리
참고: 림프구는 신선해야 하고 저장할 수 없으므로 각 실험에 대해 쥐에서 수집해야 합니다. 또한, 창 자-열대 림프 구체는 순환 흉부 덕트에서 직접 수집 해야 합니다. 모든 절차는 6시간 이내에 완료될 것으로 예상되며 모든 계측기, 장갑 및 표면은 깨끗합니다. 동물을 생리적으로 안정된 상태로 유지하기 위해서는 실험에 사용되는 모든 식염수 및 기타 유체를 따뜻하게 유지해야 합니다.
<ol><li>뜨거운 물(약 80~90°C)에 담근 후 헤파린 곡선(반경 약 5mm)과 같은 캐너레이션 튜브(1mm 직경)를 형성하고 몇 시간 전에 접착제 테이프를 사용하여 플라스틱 보드에 고정합니다.</li>
	<li>미다졸람(2mg/kg), 도미토르(0.15mg/kg), 베툴파르(2.5mg/kg)의 혼합물을 관성 주사로 남성 위스타 쥐(8-12주)를 마취시키고 모발 클리퍼를 사용하여 복부의 체모를 자른다. 모발이 복강에 들어가지 않도록 면도 후 모발을 단단히 제거합니다.</li>
	<li>절차에 필요한 마취의 안정적인 깊이가 발가락 핀치에 의해 얻어진다는 것을 확인한 후, 중간선에서 왼쪽 하위 부위까지 수평으로 수술 가위를 절개합니다. 경상부 혈관을 보면서 정수리 성 관음의 혈관을 손상시키지 않도록주의하십시오.</li>
	<li>젖은 거즈로 위를 감싸고 위장을 몸 의 오른쪽 바깥쪽으로 부드럽게 움직여 회복 기관을 드러냅니다. 척추의 발기 근육과 수술 가위를 사용하여 지방 조직 사이에 노치를 삽입하고 손가락으로 무뚝뚝하게 분리하십시오.</li>
	<li>흉부 덕트 주변의 결합 조직을 조심스럽게 제거하십시오. 과잉 결합 조직은 나이에 따라 증가합니다. 흉부 덕트의 길이가 20mm까지 소뚜럼의 왼쪽 십자군 바로 아래에서 흉부 덕트를 노출시합니다. 정밀 핀셋 또는 습식 면 면봉을 사용하여 흉부 덕트와 대어 사이에 부드럽게 접착력을 분리합니다.<ol>
<li>일부 쥐는 심혈 신경총의 높은 위치 (거미줄처럼 확산 작은 흉부 덕트)의 높은 위치로 인해 흉부 덕트 또는 짧은 흉부 덕트를 통해 교차 복부 동맥에서 분기 동맥이 있기 때문에 신중하게이 과정을 수행. 부종을 유도하지 않으려면 흉부 덕트에 불필요한 접촉을 피하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다이어프램의 왼쪽 십자군 바로 아래에 있는 흉부 덕트에 스트링(3-0 실크)으로 합자를 적용합니다. caudal 흉부 덕트가 비하됩니다.</li>
	<li>외과 가위의 절삭날을 찔러 복부 벽에 구멍(직경 5mm)을 만들고, 헤어핀 곡선 캐니밍 튜브를 통과하고, 한 지점에서 일리오피아 근육에 튜브를 리게이트합니다. 10 U/mL 헤파린을 포함하는 일반 식염수로 캐닝 튜브를 채웁니다.</li>
	<li>연재된 흉부 덕트 아래에 끈(3-0 실크)을 놓은 후, 캐뉼레이션 튜브의 날카로운 절단 가장자리로 흉부 덕트를 찌르고, 꼬리쪽으로 약 5mm를 향하게 하고, 흉부 덕트를 고정용 캐뉼레이션 튜브로 리게이트한다.</li>
	<li>탈수를 방지하기 위해 식염수를 공급하려면 정밀 핀셋을 사용하여 위 안트럼의 전방 벽에 구멍 (직경 3mm)을 만들고 실리콘 튜브 (직경 2mm)를 유로 반지를 통해 십이지장에게 전달합니다. 상처를 바느질하고 Bollman의 케이지에서 동물을 유지 한 후, 3 mL / h의 유속으로 실리콘 튜브에서 각 쥐의 십이지장에 설탕이 함유 된 식염수를 주입하기 시작합니다. 케이지 전체를 종이 타월로 덮어 따뜻하게 유지합니다.</li>
	<li>6 U/mL 헤파린, 10% 태아 소 혈청, RPMI 1640 배지(pH 7.4; 재료 표 참조)를 포함하는 얼음에 50mL 원추형 튜브의 뚜껑의 중앙에 있는 구멍에 캐닝 튜브를 고정하고, 얼음에 흉부 덕트 림프구(TDL)를 수집한다. 튜브 내부의 피브린 응고 형성으로 인한 칸누라기 튜브 폐색을 방지하기 위해 원문 관의 벽에 튜브의 끝을 접촉하지 않도록주의하십시오. 림프액(약 20mL)은 약 1.0x 10 8~109림프구를 6시간 안에 얻을 수 있다. 완전한 마취 하에 림프구를 얻기 위해 마취 평면을 모니터링하고 림프 흐름이 적절하게 관찰됩니다. 동일한 마취제는 쥐가 6 시간 동안 지속적으로 깊은 마취를 얻기 위해 발만의 케이지에 넣은 후 약 3 시간 동안 동일한 용량으로 첨가됩니다.</li>
</ol>2. 카복시플루오레세인 디아세테이트 succinimidyl 에스테르 (CFDSE)와 림프구 라벨
<ol><li>디메틸 설프산화물(DMSO)에서 15.6mM(500μg의 CFDSE가 DMSO의 60 μL로 용해됨)에 CFDSE(재료표)를 용해한다.</li>
	<li>RPMI1640의 50mL에서 37°C에서 37°C에서 30분 동안 30분 동안 림프구(1 x 108~109)를배양한다.</li>
</ol>3. 미세 혈관 연구를위한 실험 용 설정
<ol><li>미다졸람(2mg/kg), 도미토르(0.15mg/kg), 베툴파르(2.5mg/kg)의 혼합물을 관성 주사로 주사하고 발가락 핀치에 의한 마취 깊이를 확인한다. 모발 오염을 최소화하기 위해 모피를 손질하기 전에 복부를 적십니다. 그런 다음 중간 절개를 통해 받는 위스터 쥐의 복부를 엽니다.</li>
	<li>휴대용 스테인리스 스틸 플레이트(약 120 x 300mm)에 쥐를 놓고 중앙 주변에 직사각형 구멍이 유리 슬라이드(24 x 50mm)로 덮여 있습니다. 관찰을 위해 PP를 포함하여 일체 세그먼트의 약 10cm를 선택합니다.</li>
	<li>내장을 가능한 한 따뜻하게 유지하고 인산완충식염(PBS)을 37°C로 데워 보세요. PBS로 소장을 커버하는 데 사용되는 거즈를 담그십시오.</li>
	<li>2 % 이소플루란 (재료의 표 참조)와 연속 마취를 제공하면서, 현미경의 단계에 슬라이드를 넣어 일부 HEV가 세로사를 통해 실행되는 PP에서 미세 순환의 관찰에 적합한 영역을 선택합니다. P의 크기; 더 큰 것들은 CLSM을 사용하여 미세 순환의 관찰에 적합합니다. 소장은 장소에서 똑바로 하지 않습니다. 장력 없이 길이가 2cm 이상 인 직선 세그먼트는 관찰에 적합합니다.</li>
	<li>PBS에 담근 흡수성 면으로 인접한 장 세그먼트와 장간을 덮습니다. 내장 세그먼트를 두 개의 압연 면공 사이에 놓고 쥐의 심장 박동과 호흡에 의해 진동되는 것을 방지하기 위해 쥐의 몸에서 가능한 한 멀리 배치합니다.</li>
	<li>1 mL 주사기를 사용하여, 천천히 주입 (이상 1 분) CFSE 라벨 TDL (1 x 108 세포) 받는 사람 쥐의 경정맥에. 급속한 정맥 주사는 전신 순환에 영향을 미칠 수 있습니다.</li>
</ol>4. 림프구의 미세 순환
<ol><li>CLSM을 사용하여 PPs의 미세 혈관에서 TDL을 지속적으로 모니터링하고 30대 간격으로 타임랩스 사진을 사용하여 3시간 동안 컴퓨터에 기록합니다. PP의 HEV에 세로사에서 깊이는 약 25 μm, 30 μm의 깊이에 스트로마와 모세관 림프관의 관찰을 가능하게.</li>
	<li>텍사스 레드-dextran (25 mg/kg)을 각 수신자 쥐의 경정맥에 주입하여 혈류를 얼룩지게 하고 Hoechest 33342 (5 mg/kg)를 세포 핵을 얼룩지게합니다.</li>
	<li>(선택 사항) 림프구 역학을 정량화하기 위해 30초 이상 HEV에 대한 림프구를 "접착제 림프구"로 정의하고 HEV에서 기마로 이동하는 림프구를 '이동 림프구'로 정의합니다. 그런 다음 시야당 이동(림프구/접착제 림프구 마이그레이션 + 림프구 마이그레이션)의 평균 백분율을 계산합니다(약 0.3 mm2).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunity+in+gut+and+lymphoid+cell+trafficking.">Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking.</a> Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).</li><li>Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+control+of+lymphocyte+trafficking:+a+general+overview.">Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview.</a> Immunology. 116, 1-12 (2005).</li><li>Yopp, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+receptors+regulate+chemokine-driven+transendothelial+migration+of+lymph+node+but+not+splenic+T+cells.">Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells.</a> The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).</li><li>Lucke, S., Levkau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+functions+of+sphingosine-1-phosphate.">Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).</li><li>Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+collection+of+lymph+from+the+liver,+small+intestine,+or+thoracic+duct+of+the+rat.">Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat.</a> The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).</li><li>Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+of+Intestinal+Lymphoid+Follicles+in+Rat+Peyer's+Patches.">Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).</li><li>Miura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Demonstration+of+Sequential+Migration+Process+of+Lymphocyte+Subpopulations+in+Rat+Peyer's+Patches.">Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).</li><li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+cellular+movement+in+vivo+with+photoconvertible+fluorescence+protein+"Kaede"+transgenic+mice.">Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).</li><li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+of+Infected+Peyer's+Patches+Arises+From+Global,+Interferon-Receptor,+and+CD69-independent+Shutdown+of+Lymphocyte+Egress.">Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress.</a> Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).</li><li>Higashiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-Selectin-Dependent+Monocyte+Recruitment+Through+Platelet+Interaction+in+Intestinal+Microvessels+of+LPS-Treated+Mice.">P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice.</a> Microcirculation. 15, 441-450 (2008).</li><li>Shirakabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+colitis+through+blocking+lymphopcytes+entry+to+Peyer's+patches+by+sphingosine-1-phosphate+lyase+inhibitor.">Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).</li><li>Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Microscopy:+Visualizing+Immunity+in+Context.">Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+Landscape+of+In+Vivo+Immunity:+Insights+from+Dynamic+In+Situ+Imaging+of+Secondary+Lymphoid+Tissues.">Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues.</a> Immunity. 21, 331-339 (2004).</li></ol>

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여기에서 우리는 순진한 창자 열대 림프구를 수집하고 쥐 PPs에서그들의 이주를 관찰하기위한 프로토콜을 설명했다. 이 절차는 림프구가 PPs의 microvasculature에서 어떻게 움직이는지 밝히고 정상 또는 약용 조건하에서 그들의 역학을 시각적으로 비교하는 가능하게 할 수 있습니다. 이러한 역학의 직접적인 관찰은 관측 기간이 불과 몇 시간으로 제한되지만 일부 약물에 의한 면역 학적 수정에 대한 ?...

Peyer의 패치 (PPs)는 소장의 라미나 프로프리아에 있는 림프성 여포의 수백으로 이루어져 있습니다. PPs는 여포, 간 간 지역 및 항원 프리젠 테이션에 의해 림프구가 자극되는 여포의 하부에 위치한 발아 센터로 나뉩니다. 포신성 림프관이 없으며 항원들은 상피 세포 층을 통해 장 루멘에서 라미나 프로프리아를 침범합니다. 림프모를 포함하는 상피 영역은 모낭 관련 상피라고하며, 그 내에서 전문화된 M 세포가 점막 항원들을 섭취합니다. M 세포는 발광측과 항원으로부터 항원에서 항원에서 복용한 다음 수지상 세포에 의해 포획되고 높은 내피 정맥(HEV)의 내피성 정맥을 통해 PPs로 흐르는 순진한 림프구를 향해제시된다. PPs는 장 면역에 있는 중요한 역할을 하고 염증의 초기 단계와 관련있습니다. 많은 분자 상호 작용은 접착 분자, 케모키인2,3및스핑고신-1-인산염4를포함하여 이차 림프구 기관(STO)에 림프구의 입구를 포함합니다. 따라서, 많은 예상 된 치료 대상이 있다. 따라서, PPs 내의 림프구 역학을 관찰하면 염증의 초기 단계를 엿볼 수 있으며 여러 유망한 약물의 유용성을 검사 할 수 있습니다.
여기서 방법은 여러 절차 (흉부 덕트5로 의 통조림 및 수집 된 림프구로 주입 한 후 림프구 및 장기 관찰을 수집)를 포함하는 PPs에서 림프구의 이동에 초점을 맞추고 있습니다. 이러한 절차는 복잡하고 이전 보고서에서 각 절차가 수행된 방법을 정확하게 확인하기 가 어려웠기 때문에 성공적인 관찰을 달성하기 위한 몇 가지 팁을 여기에서 언급했습니다. 예를 들어, 흉부 덕트로 튜브의 캐니언은 매우 어려웠으며, 캐너레이션의 초기 성공률은 50% 미만이었습니다. 그러나, 우리는 방법을 개선하고 80 %를 초과하는 성공률을 달성했다. 우리는 여러 조건하에서 림프구의 경전 적 이동의 정량적 평가를 가능하게 하기 위하여 성공적인 관측을 위해 필요한 이 원고에 있는 몇몇 다른 팁을 언급했습니다.
이전 보고서에서는, PPs6의혈관 구조를 얼룩지게 하기 위해 인도 잉크의 정맥 주사와 같은 시간이 지남에 따라 3차원 변화를 이해하기 어려웠다, 또는 현미경은 단일 초점7인. 최근에는 Kaede 마우스와 같은 일부 광변환형 형광 단백질 트랜스제닉 동물을 이용한 관측 방법이 생체 내에서 체계적인 세포 움직임을 명확히하였다 8. 다른 연구는 PPs9에서림프구 송구의 CD69 독립적 인 종료를 명확히. 우리는 높은 분석 기능 때문에 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 (CLSM)를 사용했습니다. 이제 우리는 쉽게 고해상도 이미지를 얻고 림프구 역학을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
이 보고서에서는 PP에서 림프구 마이그레이션을 평가하는 일련의 방법을 시연했습니다. 첫째, 우리는 림프구를 수집하기 위해 흉부 덕트 캐너레이션의 세련된 방법을 보여 주었다. 둘째, 현미경 관찰하에 가능한 한 객관적인 장기를 유지하는 여러 가지 방법으로 관찰 방법을 개선하여 3시간 동안 고품질 이미지를 얻을 수 있게 했습니다. 셋째, 림프구 이동의 세포 움직임을 정량화하여 일부 약물의 효과를 평가했습니다. 이러한 수정된 프로토콜은 점막 면역학 평가의 발달에 기여할 것입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:913px;" width="913">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">A1R+</td>
			<td style="width:213px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:265px;">Comfocal Laser Scanning Microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechest 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td style="width:119px;">099-06571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Texas Red&#8211;dextran</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1863</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopic observation of lymphocyte dynamics in rat peyer's patches

순진한 림프구는 생리적인 조건 하에서 림프구에 혈액에서 재순환하고 일반적으로 창 자 면역에 중요 한 현상으로 인식. Peyer의 패치 (PPs) 또는 막질 림프절과 같은 이차 림프구의 기질은 순진한 림프구가 항원을 감지하는 곳입니다. 순진한 림프구는 높은 내피 정맥, PPs에 입력의 포털에 도달하기 위해 혈류를 통해 순환. 일부 면역 조절기는 림프구 이동에 영향을 미치는 것으로 추정되지만, 미세 순환 역학의 정밀한 평가는 매우 어렵고 생체 내에서 림프구 이동을 관찰하는 방법을 확립하는 것은 정밀한 메커니즘의 해명에 기여할 수 있다. 우리는 림프덕에서 림프구를 수집하고 쥐 PPs에서 장 열대 림프구의 상세한 역학을 관찰하는 방법을 정제했습니다. 우리는 생체 내에서 쥐 P를 관찰하기 위해 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사를 선택하고 시간 경과 사진을 사용하여 기록했습니다. 이제 림프구 역학 분석에 기여할 수 있는 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다.

림프에서 림프구 수집 흉부 덕트 캐넌션에 대한 쥐를 준비하려면 도 1에 표시된 것처럼 긴장된 흉부 덕트에서 절개를 한 다음 도 2에표시된 볼만의 케이지에서 쥐를 유지한다.
림프구가 잘 수집되면 약 20mL/6 h 림프액을 약 10 7~108/mL 림프구를 얻을 수 있습니다. TL 중 70%는 CD4를 발현하며, 그 중 약 90%의 ...

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Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches

여기서는 흉부 덕트 림프구를 수집하고 시간 경과 사진을 사용하여 3 시간 동안 쥐 페이어의 패치에서 장 열대 림프구의 이동을 관찰하는 정확한 방법을 설명합니다. 이 기술은 림프구의 역학이 염증 성 조건하에서 어떻게 영향을 받는지 명확히 할 수 있습니다.

쥐 페이어의 패치에서 림프구 역학의 현미경 관찰

Na&#239;ve lymphocytes recirculate from the blood to the lymphoid tissues under physiological condition and it is commonly recognized as an important ...

microscopic-observation-of-lymphocyte-dynamics-in-rat-peyer-s-patches

Research

JoVE Journal

Medicine

3.9K 조회수.  National Defense Medical College. 여기서는 흉부 덕트 림프구를 수집하고 시간 경과 사진을 사용하여 3 시간 동안 쥐 페이어의 패치에서 장 열대 림프구의 이동을 관찰하는 정확한 방법을 설명합니다. 이 기술은 림프구의 역학이 염증 성 조건하에서 어떻게 영향을 받는지 명확히 할 수 있습니다.

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Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Ivacaftor, 그것의 주요 대사 산물, 및 생물 학적 체액의 낭 성 섬유 증 환자에서 Lumacaftor의 임상 샘플의 높은 처리량 분석에 대 한 최적화 된 LC-MS/MS 방법

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

연구

의학

Implantation of hiPSC-derived Cardiac-muscle Patches after Myocardial Injury in a Guinea Pig Model

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss of relevant amounts of heart muscle mass can lead to the heart failure. Besides heart transplantation, there is no curative treatment option for the end-stage heart failure. In times of organ donor shortage, organ independent treatment modalities are needed. Left-ventricular assist devices are a promising therapy option, however, especially as destination therapy, limited by its side-effects like stroke, infections and bleedings. In recent years, several cardiac repair strategies including stem cell injection, cardiac progenitors or myocardial tissue engineering have been investigated. Recent improvements in cell biology allow for the differentiation of large amounts of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC). One of the cardiac repair strategies currently under evaluation is to transplant artificial heart tissue. Engineered heart tissue (EHT) is a three-dimensional in vitro created cardiomyocyte network, with functional properties of native heart tissue. We have created EHT-patches from hiPSC derived cardiomyocytes. Here we present a protocol for the induction of left ventricular myocardial cryoinjury in a guinea pig, followed by implantation of hiPSC derived EHT on the left ventricular wall.

Here we present a protocol for the induction of left ventricular cryoinjury followed by the implantation of a cardiac muscle patch, derived from human iPS-cell cardiomyocytes in a guinea pig model.

기니 돼지 모델에서 심근 손상 후 심장 근육 패치 hiPSC 파생의 이식

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss ...

A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the luminal surface area in arteries thereby reducing adequate blood flow to organs and distal tissues. Clinically, revascularization procedures such as balloon angioplasty with or without stent placement aim to restore blood flow. Although these procedures reestablish blood flow by reducing plaque burden, they damage the vessel wall, which initiates the arterial healing response. The prolonged healing response causes arterial restenosis, or re-narrowing, ultimately limiting the long-term success of these revascularization procedures. Therefore, preclinical animal models are integral for analyzing the pathophysiological mechanisms driving restenosis, and provide the opportunity to test novel therapeutic strategies. Murine models are cheaper and easier to operate on than large animal models. Balloon or wire injury are the two commonly accepted injury modalities used in murine models. Balloon injury models in particular mimic the clinical angioplasty procedure and cause adequate damage to the artery for the development of restenosis. Herein we describe the surgical details for performing and histologically analyzing the modified, pressure-controlled rat carotid artery balloon injury model. Additionally, this protocol highlights how local periadventitial application of therapeutics can be used to inhibit neointimal hyperplasia. Lastly, we present light sheet fluorescence microscopy as a novel approach for imaging and visualizing the arterial injury in three-dimensions.

The rat carotid artery balloon injury mimics the clinical angioplasty procedure performed to restore blood flow in atherosclerotic vessels. This model induces the arterial injury response by distending the arterial wall, and denuding the intimal layer of endothelial cells, ultimately causing remodeling and an intimal hyperplastic response.

쥐 경동맥 압력 제어 세그먼트 풍선 부상 과식 치료 응용 프로그램

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the ...

Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts

Ventricular tachyarrhythmias are a major cause of mortality and morbidity worldwide. Electrical defibrillation using high-energy electric shocks is currently the only treatment for life-threatening ventricular fibrillation. However, defibrillation may have side-effects, including intolerable pain, tissue damage, and worsening of prognosis, indicating a significant medical need for the development of more gentle cardiac rhythm management strategies. Besides energy-reducing electrical approaches, cardiac optogenetics was introduced as a powerful tool to influence cardiac activity using light-sensitive membrane ion channels and light pulses. In the present study, a robust and valid method for successful photostimulation of Langendorff perfused intact murine hearts will be described based on multi-site pacing applying a 3 x 3 array of micro light-emitting diodes (micro-LED). Simultaneous optical mapping of epicardial membrane voltage waves allows the investigation of the effects of region-specific stimulation and evaluates the newly induced cardiac activity directly on-site. The obtained results show that the efficacy of defibrillation is strongly dependent on the parameters chosen for photostimulation during a cardiac arrhythmia. It will be demonstrated that the illuminated area of the heart plays a crucial role for termination success as well as how the targeted control of cardiac activity during illumination for modifying arrhythmia patterns can be achieved. In summary, this technique provides a possibility to optimize the on-site mechanism manipulation on the way to real-time feedback control of cardiac rhythm and, regarding the region specificity, new approaches in reducing the potential harm to the cardiac system compared to the usage of non-specific electrical shock applications.

This work reports a method for controlling the cardiac rhythm of intact murine hearts of transgenic channelrhodopsin-2 (ChR2) mice using local photostimulation with a micro-LED array and simultaneous optical mapping of epicardial membrane potential.

쥐 심장에 광유전학적 다중 부위 광자극을 적용하여 고급 심장 리듬 관리

Ventricular tachyarrhythmias are a major cause of mortality and morbidity worldwide. Electrical defibrillation using high-energy electric shocks is ...

The Microscopic Transcanal Approach in Stapes Surgery Revisited

The microscopic transcanal (aka transmeatal) surgical approach was first described in the 60s, offering a minimally invasive means of reaching the external auditory canal, the middle ear, and epitympanon. Such an approach avoids a retroauricular or endaural skin incision; however, working through a narrow space needs angled microsurgical instruments and specific training in otologic surgery. The transcanal approach restricts the working space; however, it offers a binocular microscopic vision into the middle ear without extended skin incisions and thus, reducing post-operative pain and bleeding. In addition, this minimally invasive approach avoids scar tissue complications, hypoesthesia of the auricle, and potential protrusion of the pinna. Despite its numerous advantages, this method is still not routinely performed by otologic surgeons. Since this minimally invasive technique is more challenging, there is a need for extensive training in order for it to be widely adopted by otologic surgeons. This article provides step-by-step surgical instructions for stapes surgery and reports possible indications, pitfalls, and limitations using this microscopic transcanal technique.

This article describes the microscopic transcanal technique for stapes surgery, providing step-by-step surgical instructions for familiarizing surgeons with this approach.

등골 수술의 현미경 횡단 접근법 재검토

The microscopic transcanal (aka transmeatal) surgical approach was first described in the 60s, offering a minimally invasive means of reaching the ...

Microscopic Replantation of Penile Glans Amputation Due to Circumcision

Circumcision using a disposable stapler is becoming quite popular in China. However, improper surgical procedures also bring the risk of penile glans amputation, which is a very rare iatrogenic genital injury. Such complication is conventionally treated by simple hemostasis to achieve self-healing, early gross replantation, or delayed plastic surgery. However, these may lead to obvious unfavorable outcomes such as amputated glans loss, necrosis, malformation healing, or urethral orifice stenosis. In the present study, we adopted microscopic replantation as an emergency approach to achieve the precise anastomoses and anatomic reconstruction of penile glans. The goal of this protocol is to present a detailed emergency management strategy with meticulous surgical skills for the penile glans amputation. The postoperative results showed that the original shape of the glans was perfectly restored with satisfactory cosmetic appearance. The micturition function was completely restored to normal without any obvious complications. There was also no significant reduction in the sensation of amputated glans area. Hence, early meticulous microscopic replantation as soon as possible is an ideal emergency management strategy for the penile glans amputation due to circumcision.

The present protocol describes the emergency management of microscopic replantation of penile glans amputation due to circumcision.

할례로 인한 음경 글랜 절단의 현미경 재재배

Circumcision using a disposable stapler is becoming quite popular in China. However, improper surgical procedures also bring the risk of penile glans ...

Microscopic Cyst Resection for the Treatment of Patients Diagnosed with Epididymal Cyst

Epididymal cysts mostly occur in men aged 20-40 years old. Previous reports have covered concerns about postoperative complexes, including postoperative asoedema, hematoma, sustaining pain, and seminal tract obstruction in patients who have undertaken nonmicroscopic epididymal cyst resection or epididymal resection. Nonmicroscopic epididymal cyst surgery is suggested for patients with childbirth plans as a precaution. The treatment of male epididymal cysts via microtechnology is obviously a beneficial option; we took the lead in carrying out microscopic epididymal exploration and cyst resection surgery in China. From September 2017 to April 2021, 41 young and middle-aged male patients diagnosed with epididymal cysts underwent microtechnology treatment in a program titled &#34;microscopic epididymal exploration and cystectomy&#34;. The postoperative follow-up lasted for 3-50 months. The results confirmed that, as microscopic manipulation largely improved visualization of the subtle tissue structures of the epididymis, the cyst could be clearly dissected apart and completely removed intact under the microscope. Bleeding during the operation was significantly reduced (2-3 mL) and wound drainage was not required. According to follow-up data, microscopic treatment significantly reduced the incidence of postoperative scrotal hematoma, edema, and long-term postoperative pain, thereby promising a higher surgical success rate as well as recurrence prevention. Besides, preliminary experience and reflection suggest that microscopic epididymal exploration and cystectomy provide efficient preservation of the epididymal patency through refined treatment, while a better prognosis can be achieved. We recommend that surgery be carried out before the epididymal cyst develops to 0.8 cm in diameter, for fear that a larger epididymal cyst (&#62;0.9 cm in diameter) could cause the complete destruction of all tubules of the ipsilateral epididymis - a more severe case with damage to the testicular output network.

Here, we present a protocol to treat patients diagnosed with an epididymal cyst using microscopic cyst resection. Based on microscopic manipulation, a largely improved visualization of the subtle tissue structures of the epididymis was obtained, so the cyst could be clearly dissected apart and completely removed intact.

부고환 낭종으로 진단된 환자의 치료를 위한 현미경적 낭종 절제술

Epididymal cysts mostly occur in men aged 20-40 years old. Previous reports have covered concerns about postoperative complexes, including postoperative ...

Microscopic Electric Rotary Grinding of Plaques Combined with Graft Repair in the Management of Peyronie's Disease

Peyronie's Disease (PD) is clinically characterized by the development of localized fibrous plaques, primarily on the tunica albuginea, especially on the dorsal area of the penis. These plaques are the hallmark feature of this condition, resulting in penile curvature, deformity, and painful erections for affected individuals. Although various nonsurgical treatment options exist, their overall effectiveness is limited. As a result, surgical intervention has become the ultimate choice for patients with severe penile curvature deformities and associated erectile dysfunction. Our research team has successfully employed a combined approach involving microscopic electric rotary grinding of the fibrous plaques and the use of tunica vaginalis or bovine pericardium as graft materials for the repairing of the defects of tunica albuginea in the treatment of PD. This approach has consistently yielded highly satisfactory results regarding the restoration of penile shape, with excellent cosmetic results and significantly improved sexual satisfaction. 
This protocol aims to present a comprehensive surgical management strategy utilizing electric rotary grinding of the plaques and repairing the defects of tunica albuginea by using the tunica vaginalis, which represents an optimal surgical strategy for treating PD.

The presented protocol describes a microscopic surgical method for the treatment of Peyronie's disease by using electric rotary grinding of the plaques followed by using the tunica vaginalis or bovine pericardium as a graft for the repairing of the defects of the tunica albuginea.

Peyronie's Disease 관리에서 이식편 수리와 결합된 플라크의 미세한 전기 회전 분쇄

Peyronie's Disease (PD) is clinically characterized by the development of localized fibrous plaques, primarily on the tunica albuginea, especially on the ...

<meta charset="utf8"></head><body>위장관 역학 및 운동성에 대한 약물 효과를 연구하기 위한 프로토콜

Using An In Vitro Tissue Perfusion System to Detect the Functional Activities of Isolated Intestinal Tubes in Real Time

Gastrointestinal diseases, which have a high incidence, pose considerable challenges for humans. The small intestine is integral to food and drug digestion and absorption and plays a crucial role in treating these diseases. The intestinal tube movement experiment, a common and essential in vitro method, is utilized to study gastrointestinal dynamics. This includes the preparation of the isolated intestinal tube, as well as the suspension of the prepared intestinal tube in the bath and its connection to a signal detector. This is followed by the recording and analysis of a series of parameters, such as tension, which can be used to assess intestinal motor function, as well as considerations for keeping the intestinal tube active in vitro. The standardized program from sampling to data collection greatly improves the repeatability of the experimental data and ensures the authenticity of the recording of intestinal tension after physiological, pathological, and drug intervention. Here we present the key problems in experimental operation and a valuable reference experimental protocol for studying drugs that regulate gastrointestinal motility.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Rat Intestinal Tubes에 대한 약물 영향에 대한 신뢰할 수 있고 재현성 있는 In Vitro 평가

We present a method for isolating rat intestinal tubes and assessing the impact of drugs on their tension, frequency, and amplitude in vitro. This method offers a valuable approach for researchers investigating intestinal tubes.