이 작품은 Carraresi Foundation과 MiND FoodS Hub ID : 1176436가 자금을 지원했습니다. 모든 저자는 COST Action CA16119 시험관내 3-D 총 세포 안내 및 적합성 (CellFit)의 회원입니다.

모든 연구는 밀라노 대학의 윤리위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다. 모든 동물 실험은 미국 국립 보건원 (NIH)에 의해 출판 된 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 가이드에 따라 수행되었습니다. 건강한 성인 개인으로부터의 인간 세포 분리는 밀라노의 Ospedale Maggiore Policlinico의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 우리 연구의 모든 방법은 승인 된 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 피부 섬유아세포 분리
참고: 아래에 설명된 모든 절차는 마우스, 돼지 및 인간을 포함한 다른 포유동물 종으로부터 분리된 섬유아세포에 적용될 수 있다. 뮤린 세포를 7주령의 수컷 마우스로부터 분리하고, 돼지 피부 조직을 지역 도살장에서 수집하였다. 인간 세포는 서면 정보에 입각한 동의 후에 성인 환자로부터 분리되었다.
<ol><li>0.1 % 돼지 젤라틴 용액을 준비하십시오.<ol>
<li>돼지 젤라틴 0.1g을 무게로 100mL의 물에 녹인다. 사용하기 전에 오토클레이빙을 통해 젤라틴 용액을 살균하십시오.</li>
		<li>35 mm 페트리 접시를 0.1% 돼지 젤라틴과 함께 코팅하여 준비된 용액 1.5 mL를 첨가한다. 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>약 2-5cm 길이의 포유류(마우스, 돼지 및 인간) 피부 생검을 절단하고 2% 항생제 항균 용액을 함유하는 둘베코의 인산염 완충 식염수(PBS)에 넣는다. 사용 전까지 + 4°C에서 보관하십시오. 참고 : 생검 수집은 합의하에 그리고 윤리위원회의 승인 후에 확립 된 지침에 따라 수행되어야합니다.</li>
	<li>수집된 생검을 2% 항생제 항균 용액을 함유하는 신선한 멸균 PBS에서 세 번 광범위하게 세척한다.</li>
	<li>마지막 세척에서 생검을 수집하여 멸균 된 100mm 페트리 접시에 넣으십시오. 멸균 메스를 사용하여 약 2mm3 크기의 조각으로 자릅니다.</li>
	<li>2시간 인큐베이션이 끝날 때, 35 mm 페트리 디쉬(단계 1.1.2에 기재됨)로부터 과량의 젤라틴 용액을 제거하고, 멸균 수술용 트위저를 사용하여, 즉시 5-6개의 피부 단편을 각각의 예비코팅된 배양 접시에 넣는다.</li>
	<li>단편을 100 μL 액적의 섬유아세포 분리 배지 (표 1)를 그들 각각에 첨가하여 적시다. 5%CO2 배양기에서 37°C에서 배양한다. 참고: 배지가 증발하지 않도록 하려면 멸균수가 들어있는 100mm 이상의 페트리 접시 내에 35mm 페트리 접시를 놓습니다. 페트리 요리를 모두 뚜껑을 닫으십시오.</li>
	<li>24시간 배양 후, 35 mm 배양 페트리 디쉬에서 배지의 양을 확인하였다. 필요한 경우, 500 μL의 섬유아세포 분리 배지를 첨가하여 단편을 습윤 상태로 유지한다.</li>
	<li>배지를 조심스럽게 제거하고 피펫을 사용하여 배양 후 적어도 2일마다 새로 고칩니다.</li>
	<li>섬유아세포가 피부 단편으로부터 성장하기 시작하면, 35 mm 페트리 디쉬(단계 1.5에 기재됨)에 넣고 세포 단일층을 형성하기 시작한다(보통 6일). 멸균 수술용 핀셋을 이용하여 피부 조각을 제거하고 2 mL의 섬유아세포 분리 배지에서 배양하였다.</li>
	<li>세포 단일층을 80% 합류될 때까지 5%CO2 배양기에서 37°C에서 계속 배양하고 격일로 배지를 리프레시한다.</li>
</ol>2. 섬유아세포 1차 세포주 배양
<ol><li>섬유아세포가 80% 합류에 도달하면, 섬유아세포 분리 배지를 조심스럽게 제거하고 1% 항생제 항균 용액을 함유하는 PBS 3 mL로 세포를 3회 세척한다.</li>
	<li>세포 분리를 위해, 배양 접시에 0.25% 트립신-EDTA 용액 600 μL를 첨가하고, 3-5분 동안 37°C에서 인큐베이션한다.</li>
	<li>섬유아세포 배양 배지 5.4 mL를 첨가하여 세포가 배양 접시에서 분리되기 시작할 때 트립신을 중화시킨다(표 1).</li>
	<li>반복적이고 부드러운 피펫팅으로 세포를 제거합니다. 새로운 배양 접시 (젤라틴 제외)에서 플레이트 세포를 1 : 2와 1 : 4 사이의 통과 비율을 유지합니다 (성장 속도에 따라 다름). 참고: 원심분리는 필요하지 않습니다.</li>
	<li>배양물에 세포를 유지하고 80 % confluency에 도달 할 때까지 2 일마다 배지를 변경하고 통과시킵니다. 참고 : 활발한 성장을 유지하기 위해 일주일에 두 번 섬유 아세포를 전파하십시오.</li>
</ol>3. 5-aza-CR에 섬유아세포 노출
<ol><li>신선한 1 mM 5-aza-CR 원액을 준비하십시오.<ol>
<li>2.44 mg의 5-aza-CR을 재가량 10 mL의 DMEM 고포도당에 용해시킨다. 볼텍싱하여 분말을 재현탁하십시오. 0.22 μm 필터로 용액을 멸균하십시오. 참고: 5-aza-CR 원액은 사용 직전에 준비해야 합니다.</li>
		<li>섬유아세포 배양액 1 mL에 5-aza-CR 원액(3.1.1.) 1 μL를 희석하여 5-aza-CR 작업액을 제조하였다. 참고: 5-aza-CR 작동 용액의 농도는 1 μM 1,2,3,8,9입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>앞서 기술한 바와 같이 세포를 트립신화하고(2.1.-2.3.) 반복적이고 부드럽게 피펫팅함으로써 세포를 제거한다.</li>
	<li>세포 현탁액을 수집하여 원뿔형 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>실온에서 광학 현미경 하에서 카운팅 챔버를 사용하여 세포를 계수한다. 1 μM 5-aza-CR로 보충된 섬유아세포 배양 배지 30 μL에 4 x 104 세포를 수득하기 위해 세포를 재현탁하는데 필요한 배지의 부피를 계산한다(단계 3.1.2 참조). 참고: 사용할 수식은 챔버의 특정 유형에 따라 다릅니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61655/61655equ01v3.jpg">
</li>
	<li>세포 현탁액을 실온에서 5분 동안 150 x g 에서 원심분리한다. 상청액을 제거하고 1 μM 5-aza-CR로 보충된 섬유아세포 배양 배지로 펠렛을 재현탁시켰다(단계 3.1.2 참조). 사용되는 섬유아세포 배양 배지의 부피에 대해서는 단계 3.4를 참조한다. 주: 음성 대조군으로서, 세포를 5-aza-CR 없이 섬유아세포 배양 배지에 동일한 농도로 재현탁시키고 PTFE 분말로 세포 캡슐화를 진행한다(단계 4.1.-4.13.).</li>
</ol>4. PTFE 마이크로 생물 반응기에서 섬유 아세포 캡슐화
<ol><li>35mm 페트리 접시에 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 분말을 채워 침대를 만듭니다(그림 1A). 참고: 액체 대리석 접착을 피하기 위해 35mm 세균학 페트리 접시를 사용하십시오. 얇은 소수성 및 다공성 쉘을 얻기 위해, 평균 입자 크기가 1 μm인 PTFE 분말을 사용하고 최대 분쇄 2.0 NPIRI로 제작하였다. 이것은 가스 투과성 액체 대리석의 생성을 허용합니다. 더욱이, 반투명 코팅은 실시간으로 세포 응집 과정의 관찰을 용이하게 하고, 입자 크기가 커질수록 높은 증발, 구형 형상의 기형 및 손실, 및 마이크로생물반응기의 조기 용해를 야기할 수 있는 높은 다분산성을 유도한다.</li>
	<li>4 x 104 세포가 들어있는 30 μL 단일 액적(단계 3.4.- 3.5 참조)을 파우더 베드 상에 분주한다(그림 1B).</li>
	<li>35mm 페트리 접시를 원형 운동으로 부드럽게 회전시켜 PFTE 분말이 액체 방울의 표면을 완전히 덮도록 하여 액체 대리석 마이크로 생물반응기를 형성합니다(그림 1C).</li>
	<li>대리석의 직경을 수용하기 위해 가장자리에서 자른 1,000 μL 피펫 팁을 사용하여 액체 대리석 마이크로 생물 반응기를 집어 들으십시오 (그림 1D, E). 액체 대리석 마이크로 생물반응기를 깨끗한 박테리아학 페트리 접시 상에 플레이트화하여 안정화시킨다(도 1F). 참고: 팁 내부의 대리석을 잡기 위해 마찰을 일으키려면 피펫 끝을 액체 대리석 직경보다 약간 작은 직경으로 자릅니다.</li>
	<li>액체 대리석 마이크로 생물반응기를 페트리 접시에서 96웰 플레이트(하나의 대리석/웰)로 옮깁니다(그림 1G).</li>
	<li>웰의 여백에서 100μL의 배지를 천천히 첨가한다. 마이크로 생물반응기는 배지 위에 떠 다니기 시작합니다(그림 1H). 참고 : 마이크로 생물 반응기는 PTFE 소수성의 붕괴로 인해 직접 액체 접촉에서 중단됩니다. 대안적인 접근법으로서, 액체 대리석 마이크로바이오리액터는 35 mm 세균학 배양 접시에 개별적으로 배치될 수 있다. 이 경우, 액체 대리석 증발을 방지하기 위해, 마이크로 생물반응기가 들어있는 35mm 페트리 접시를 100mm 페트리 접시에 삽입해야 하며, 이전에는 멸균수로 분취되어야 합니다.</li>
	<li>액체 대리석 마이크로바이오리액터를 5% CO2 인큐베이터 1,2,3,8,9에서 37°C에서 18시간 동안 인큐베이션한다. 참고: 1μm의 PTFE 입자 크기는 내부 액체와 주변 환경 간의 최적의 가스 교환을 보장할 수 있습니다.</li>
	<li>18시간 동안 5-aza-CR 인큐베이션한 후, 가장자리에서 절단된 1,000 μL 피펫 팁을 사용하여 액체 대리석 마이크로생물반응기를 수집하였다(단계 4.5 참조).</li>
	<li>마이크로 생물반응기를 새로운 35mm 박테리아 페트리 접시에 넣습니다(그림 1D-F).</li>
	<li>바늘을 사용하여 액체 대리석에 구멍을 뚫고 부러 뜨립니다.</li>
	<li>입체 현미경으로 가장자리에서 절단한 200μL 피펫 팁으로 형성된 구상체를 회수합니다(그림 1I,J). 참고: PTFE로 캡슐화된 후성유전학적으로 소거된 세포는 3D 구형 구조(각 액체 대리석에 하나의 응집체)를 형성합니다.</li>
	<li>5-aza-CR에 대한 반응에서 다능성 상태의 획득을 평가하기 위해, 정성적 PCR에 의해 다능성-관련 유전자 발현, OCT4, NANOG, REX1 및 SOX2의 발병을 확인하였다(표 2).</li>
	<li>아래에 설명된 대로 프로토콜의 두 번째 단계를 진행합니다.</li>
</ol>5. 후성유전학적으로 지워진 세포의 PTFE 마이크로바이오리액터에서의 배양
<ol><li>신선한 ESC 배지를 준비한다(표 1).</li>
	<li>오가노이드를 5-aza-CR 잔차를 세척하기 위한 ESC 배지를 함유하는 페트리 접시에 옮긴다(단계 5.1.-5.2 참조).</li>
	<li>PTFE 파우더 베드를 함유하는 새로운 35mm 세균학 페트리 접시를 준비한다(또한 단계 4.1 참조).</li>
	<li>단일 오가노이드를 30 μL ESC 배지의 액적에 분주하여 200 μL 피펫 팁을 이용하여 분말 베드 상에 분주하고, 가장자리에서 절단한다(단계 4.9 참조; 5.3.).</li>
	<li>원형 운동으로 35mm 페트리 접시를 부드럽게 회전시켜 새로운 액체 대리석 마이크로 바이오 리액터를 형성하고, 1,000 μL 피펫 팁을 사용하여 픽업하고, 가장자리에서 자르고, 새로 형성된 마이크로 생물 반응기를 96 웰 플레이트 (하나의 대리석 / 웰)의 웰에 놓습니다 (단계 4.3.-4.6 참조).</li>
	<li>마이크로 생물반응기를 부유시키려면, 우물의 여백에서 100μL의 배지를 첨가하여 대리석을 천천히 목욕시킨다(참고 4.7 참조).</li>
	<li>액체 대리석 마이크로바이오리액터를 필요한 기간 동안 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다. 5.3.-5.7에 설명된 절차에 따라 격일로 배지를 변경한다. 참고 : 본 원고에서는 28 일 동안 오가노이드 배양으로 얻은 결과가 제공됩니다. 그러나, 필요하다면 더 긴 배양 기간이 수행될 수 있다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+demethylation+step+allows+the+conversion+of+adult+human+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells.">Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).</li><li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+pig+dermal+fibroblast+into+insulin+secreting+cells+by+a+brief+exposure+to+5-aza-cytidine.">Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).</li><li>Brevini, T. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+molecular+changes+of+human+granulosa+cells+exposed+to+5-azacytidine+and+addressed+toward+muscular+differentiation.">Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).</li><li>Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+azacytidine+step+allows+the+conversion+of+suspension+human+fibroblasts+into+neural+progenitor-like+cells.">Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells.</a> Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).</li><li>Tan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+tissue+engineering+and+regeneration+through+epigenetic+reprogramming+and+scaffold+manipulation.">Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation.</a> Scientific Reports. 5, 16333 (2015).</li><li>Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+conversion+of+adult+dog+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells.">Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).</li><li>Chandrakanthan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF-AB+and+5-Azacytidine+induce+conversion+of+somatic+cells+into+tissue-regenerative+multipotent+stem+cells.">PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).</li><li>Manzoni, E. F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-azacytidine+affects+TET2+and+histone+transcription+and+reshapes+morphology+of+human+skin+fibroblasts.">5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts.</a> Scientific Reports. 6, 37017 (2016).</li><li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+erasing+and+pancreatic+differentiation+of+dermal+fibroblasts+into+insulin-producing+cells+are+boosted+by+the+use+of+low-stiffness+substrate.">Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate.</a> Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).</li><li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+PTFE+micro-bioreactor+to+promote+3D+cell+rearrangement+and+maintain+high+plasticity+in+epigenetically+erased+fibroblasts.">Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).</li><li>Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+striated+muscle+cells+from+non-myoblast+precursors+following+5-azacytidine+treatment.">Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment.</a> Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).</li><li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1/2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine.">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li><li>Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Azacytidine,+DNA+methylation,+and+differentiation.">5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).</li><li>Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5-azacytidine+and+its+2'-deoxyderivative+on+cell+differentiation+and+DNA+methylation.">Effects of 5-azacytidine and its 2'-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).</li><li>Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+inhibitor+5-Aza-2'-deoxycytidine+induces+reversible+genome-wide+DNA+damage+that+is+distinctly+influenced+by+DNA+methyltransferases+1+and+3B.">DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).</li><li>Vining, K. H., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+forces+direct+stem+cell+behaviour+in+development+and+regeneration.">Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728 (2017).</li><li>Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+influences+of+mechanical+forces+on+cell+competition.">Multiple influences of mechanical forces on cell competition.</a> Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).</li><li>Yim, E. K., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-dependent+cell+signaling+in+stem+cell+differentiation.">Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 3 (5), 41 (2012).</li><li>Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+mediates+tissue-specific+gene+expression+in+mammary+epithelia.">Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia.</a> The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).</li><li>Christman, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Azacytidine+and+5-aza-2[prime]-deoxycytidine+as+inhibitors+of+DNA+methylation:+mechanistic+studies+and+their+implications+for+cancer+therapy.">5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy.</a> Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).</li><li>Stresemann, C., Lyko, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modes+of+action+of+the+DNA+methyltransferase+inhibitors+azacytidine+and+decitabine.">Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine.</a> International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).</li><li>Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+technique+for+in+vitro+maturation+of+sheep+oocytes+in+a+liquid+marble+microbioreactor.">A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).</li><li>Vadivelu, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+multiple+spheroid+model+of+olfactory+ensheathing+cells+using+floating+liquid+marbles.">Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles.</a> Scientific Reports. 5, 15083 (2015).</li><li>Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+Marble+as+bioreactor+for+engineering+three-dimensional+toroid+tissues.">Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12388 (2017).</li><li>Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+Marbles+as+bioreactors+for+the+study+of+three-dimensional+cell+interactions.">Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions.</a> Biomedical Microdevices. 19 (2), 31 (2017).</li><li>Varelas, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAZ+controls+Smad+nucleocytoplasmic+shuttling+and+regulates+human+embryonic+stem-cell+self-renewal.">TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal.</a> Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).</li><li>Panciera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Expandable+Tissue-Specific+Stem/Progenitor+Cells+through+Transient+Expression+of+YAP/TAZ.">Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).</li><li>Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+signaling-directed+YAP/TAZ+regulation+encourages+3D+spheroid+colony+formation+and+boosts+plasticity+of+parthenogenetic+stem+cells.">Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

지난 수십 년 동안 여러 연구는 말기 분화 된 세포를 덜 헌신적이고 더 높은 허용 상태로 되돌리기위한 전략 개발에 중점을 두었습니다. 여기에 기술된 프로토콜은 성숙한 성숙 말단 분화된 세포로부터 출발하는 다능성 세포의 생성 및 장기 유지를 허용한다. 이 방법은 화학적 후성 유전 적 소거를 통해 달성되는 높은 허용 상태의 유도와 3D 배양 시스템을 사용하여 보장 된 후속 유지 보수를 포함?...

지난 수십 년 동안, 세포 투입 및 분화를 향한 단방향 진행에 대한 널리 받아 들여지는 개념이 완전히 개정되었습니다. 세포 사양을 되돌릴 수 있고, 말단으로 분화된 세포는 다른 방법을 사용하여 덜 헌신적이고 더 높은 허용 상태로 밀릴 수 있다는 것이 입증되었다.
제안 된 몇 가지 방법 중 가장 유망한 방법 중 하나는 세포를 소위 화학적으로 유도 된 다능성으로 유도하기 위해 화학 화합물을 사용하는 것입니다. 이 접근법에 사용 된 소분자는 성인 성숙 세포의 후성 유전 학적 서명과 상호 작용하고 수정할 수있어 트랜스제닉 및 / 또는 바이러스 벡터1,2,3,4,5,6,7,8,9,10의 필요성을 피할 수 있습니다. . 최근 수많은 연구에 따르면 하이퍼메틸화 유전자 11,12,13,14,15의 재활성화를 유도하는 특정 생화학적 및 생물학적 자극을 제공함으로써 세포를 한 표현형에서 다른 표현형으로 전환시킬 수 있음을 보여주었습니다. 이러한 탈메틸화 사건은 말단으로 분화된 세포를 원시적 선조, 다능성 또는 높은 가소성/다능성 세포 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10으로 전환시키는 것을 허용한다.
동시에, 많은 연구들이 최근 메카노센싱 관련 단서에 대한 이해, 더 구체적으로는 기계적 힘을 사용하여 세포 가소성 및/또는 분화에 직접적으로 영향을 미칠 가능성에 초점을 맞추고 있다16,17,18,19. 실제로, 세포외 기질 (ECM)이 세포 운명의 조절에 중요한 역할을한다는 것이 명확하게 입증되었습니다. 특히, ECM에 의해 생성된 생체역학적 및 생물물리학적 신호는 분자 메커니즘 및 신호전달 경로를 직접 조절하여 세포 거동 및 기능(20,21)에 영향을 미친다. 이러한 최근의 데이터는 생체 내 세포 미세 환경을보다 밀접하게 모방하고 세포 행동을 유도하는 기계적 및 물리적 자극을 복제하는 새로운 3D 배양 시스템의 개발로 향하는 길을 열었습니다.
여기서는 화학적 후성유전학적 지우기와 메카노센싱 관련 단서를 결합하여 포유류 다능성 세포를 생성하는 두 단계 프로토콜을 설명합니다. 첫 번째 단계에서, 세포는 탈메틸화 분자 5-아자-시티딘 (5-aza-CR)과 함께 인큐베이션된다. 이 작용제는 직접 10-열한 전좌 2 (TET2)-매개 작용8,10 및 DNA 메틸트랜스퍼라제 (DNMT)22,23의 간접적 억제의 조합 효과를 통해 상당한 글로벌 DNA 탈메틸화를 유도할 수 있다. 이 단계는 다능성 관련 유전자 발현의 후속 재활성화와 함께 후성유전학적 블록의 제거를 유도하고, 따라서, 높은 가소성 세포 1,2,3,8,10, 이하 "후성유전학적으로 소거된 세포"로 지칭된다. 두 번째 단계에서, 세포는 3D 배양 시스템에 캡슐화된다. 이를 위해, 비반응성 소수성 합성 화합물 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE; 입자 크기가 1 μm)을 마이크로생물반응기로 사용하며, 이는 전통적인 2D 배양 시스템(10)의 사용을 통해 달성할 수 없는 세포 미세환경의 생성을 허용한다. PTFE 분말 입자는 세포가 다시 현탁되는 액체 방울의 표면에 부착되고, 내부 액체와 주변 환경(24) 사이의 가스 교환을 허용하면서 지지 표면으로부터 액체 코어를 분리한다. 이렇게 얻어진 "PTFE 마이크로바이오리액터"는, "리퀴드 마블"로도 알려져 있으며, 세포들이 서로 자유롭게 상호작용하도록 장려하여, 3D 세포 재배열(25,26,27)을 촉진하고, 바이오메카노센싱-관련 단서들(10)에도 불구하고 획득된 높은 가소성 상태를 연장하고 안정적으로 유지한다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7522</td>
			<td>Component of ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Azacytidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2385</td>
			<td>5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4036</td>
			<td>Component of nucleoside mix for ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>Component of fibroblast and ESC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Real-Time PCR</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>NA</td>
			<td>Thermal cycler for quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4654</td>
			<td>Component of nucleoside mix for ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41966052</td>
			<td>For fibroblast isolation and culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31885023</td>
			<td>For ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5652</td>
			<td>PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61021</td>
			<td>mRNA estraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td>Component of ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Component of fibroblast and ESC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td>Component of ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td>For dish coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneAmp PCR System 2700</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Thermal cycler for qualitative PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Global DNA Methylation ELISA Kit</td>
			<td>CELL BIOLABS</td>
			<td>STA-380</td>
			<td>Methylation study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7801</td>
			<td>Qualitative PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6264</td>
			<td>Component of nucleoside mix for ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31550031</td>
			<td>For ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Component of ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOVA glasstic slide 10 with grids</td>
			<td>Hycor Biomedical</td>
			<td>87144</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ APO Stereo Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td>For organoid observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Component of fibroblast and ESC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>Component of ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GS 0.22 &#181;m pore filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SB</td>
			<td>For solution sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3681</td>
			<td>mRNA reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51119000</td>
			<td>For ELISA plate reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>For cell observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Thermal Cycler 480</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Thermal cycler for reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(tetrafluoroethylene) 1 &#956;m particle size</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>430935</td>
			<td>For generating micro-bioreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K182001</td>
			<td>Genomic DNA estraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1728</td>
			<td>Quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1895</td>
			<td>Component of nucleoside mix for ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833902</td>
			<td>For fibroblast isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833900</td>
			<td>For Fibroblast isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833900500</td>
			<td>Bacteriology petri dish for liquid marble culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833924005</td>
			<td>For liquid marble culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3924</td>
			<td>For fibroblast dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 15ml, 120x17mm, PS</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62553041</td>
			<td>For cell suspension centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3003</td>
			<td>Component of nucleoside mix for ESC medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a two-step strategy that combines epigenetic modification and biomechanical cues to generate mammalian pluripotent cells

세포 표현형은 다른 방법으로 역전되거나 변형될 수 있으며, 각 기술에 특정한 장점과 한계가 있다. 여기서 우리는 화학적 후성 유전 적 지우기와 메카노 센싱 관련 단서의 사용을 결합하여 포유류 다능성 세포를 생성하는 새로운 전략을 설명합니다. 두 가지 주요 단계가 필요합니다. 첫 번째 단계에서, 성숙한(말단 분화된) 세포는 후성유전학적 지우개 5-아자-시티딘에 노출되어 다능성 상태로 그들을 구동시킨다. 프로토콜의 이 부분은 세포 운명 및 분화를 조절하는 후성유전학적 메커니즘에 대한 이해의 증가에 기초하여 개발되었으며, 후성유전학적 개질제를 사용하여 세포 분화 상태를 지운 다음 일시적인 높은 가소성 창으로 구동하는 것을 포함한다.
두 번째 단계에서, 지워진 세포는 액체 대리석으로도 알려진 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 마이크로 생물반응기에 캡슐화되어 획득한 높은 소성을 연장하고 안정적으로 유지하기 위해 3D 세포 재배열을 촉진합니다. PTFE는 비 반응성 소수성 합성 화합물이며 그 사용은 전통적인 2D 배양 시스템에서 달성 될 수없는 세포 미세 환경의 생성을 허용합니다. 이 시스템은 바이오 메카노센싱 관련 단서에도 불구하고 다능성의 유지를 장려하고 강화합니다.
여기에 설명 된 기술 절차는 성인 체세포에서 높은 가소성 상태의 유도 및 유지를 허용하는 간단한 전략입니다. 이 프로토콜은 시험된 모든 포유동물 종에서 높은 가소성 세포의 유도를 허용하였다. 유전자 형질감염의 사용을 수반하지 않으며 바이러스 벡터가 없기 때문에, 번역 의학 응용을 위한 주목할 만한 기술적 진보를 나타낼 수 있다. 더욱이, 마이크로바이오리액터 시스템은 높은 가소성 세포, 즉 ESC, iPSCs, 후성유전학적으로 소거된 세포 및 MSCs의 장기 배양을 허용하는 특정 마이크로환경을 시험관내 재생성함으로써 줄기 세포 오가노이드 기술의 주목할만한 발전을 제공한다.

본 프로토콜은 성체 체세포로부터 포유동물 다능성 세포를 생성하고 안정적으로 유지하기 위해 수행되는 모든 단계를 기술한다. 이 방법은 상이한 포유동물 종, 즉 마우스, 돼지 및 인간으로부터 분리된 섬유아세포로 성공적이었다. 여기에 보고된 대표적인 결과는 기원의 종에 관계없이 모든 세포주로부터 얻어진다.
형태학적 분석은, 탈메틸화제 5-aza-CR과 함께 18시간 인큐베...

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A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

여기서는 화학적 후성유전학적 소거와 메카노센싱 관련 단서를 결합하여 유전자 형질감염이나 레트로바이러스 벡터가 필요 없이 포유동물 다능성 세포를 효율적으로 생성하는 방법을 제시한다. 따라서이 전략은 번역 의학에 유망하며 줄기 세포 오가노이드 기술의 주목할만한 발전을 나타냅니다.

후성유전학적 변형과 생체역학적 단서를 결합하여 포유류 다능성 세포를 생성하는 두 단계 전략

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

a-two-step-strategy-that-combines-epigenetic-modification

Research

JoVE Journal

Biology

2.2K 조회수.  Università degli Studi di Milano. 여기서는 화학적 후성유전학적 소거와 메카노센싱 관련 단서를 결합하여 유전자 형질감염이나 레트로바이러스 벡터가 필요 없이 포유동물 다능성 세포를 효율적으로 생성하는 방법을 제시한다. 따라서이 전략은 번역 의학에 유망하며 줄기 세포 오가노이드 기술의 주목할만한 발전을 나타냅니다.

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Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

포유 동물 세포를 Trypsinizing 및 Subculturing

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

연구

생물학

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

인간의 세포에서 활성 유전자 발현의 어세 동적 히스톤 수정을 염색질 Immunoprecipitation (칩)

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

포유류의 세포에서 Endoplasmic 소포체 현지화 mRNAs의 시각화

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. Protein purification protocols should combine efficiency, simplicity and cost effectiveness1. Here, we describe the GST-His method as a new small-scale affinity purification system for recombinant proteins, based on a N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST)2,3 and a C-terminal 10xHis tag4, which are both fused to the protein of interest. The latter construct is used to generate baculoviruses, for infection of Sf9 infected cells for protein expression5. GST is a rather long tag (29 kDa) which serves to ensure purification efficiency. However, it might influence physiological properties of the protein. Hence, it is subsequently cleaved off the protein using the PreScission enzyme6. In order to ensure maximum purity and to remove the cleaved GST, we added a second affinity purification step based on the comparatively small His-Tag. Importantly, our technique is based on two different tags flanking the two ends of the protein, which is an efficient tool to remove degraded proteins and, therefore, enriches full-length proteins. The method presented here does not require an expensive instrumental setup, such as FPLC. Additionally, we incorporated MgCl2 and ATP washes to remove heat shock protein impurities and nuclease treatment to abolish contaminating nucleic acids. In summary, the combination of two different tags flanking the N- and the C-terminal and the capability to cleave off one of the tags, guaranties the recovery of a highly purified and full-length protein of interest.

In the present protocol, we demonstrate a highly efficient and cost-effective small-scale protein purification method, which allows purification of recombinant proteins by uniquely combining a cleavable GST-tag and a small His-tag.

GST - 그의 정화 : 전체 길이 정제 된 단백질을 항복 2 단계 친화력 정화 프로토콜

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

2 단계 콜라게나 제 관류 절차에 의한 인간의 간세포의 분리

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking metabolism and inflammation (e.g.&#160;hepatic steatosis)1,2. There has been much progress in the identification of agonist ligands for PXR, however, there are limited descriptions of drug-like antagonists and their binding sites on PXR3,4,5. A critical barrier has been the inability to efficiently purify full-length protein for structural studies with antagonists despite the fact that PXR was cloned and characterized in 1998. Our laboratory developed a novel high throughput yeast based two-hybrid assay to define an antagonist, ketoconazole&#39;s, binding residues on PXR6. Our method involves creating mutational libraries that would rescue the effect of single mutations on the AF-2 surface of PXR expected to interact with ketoconazole. Rescue or &#34;gain-of-function&#34; second mutations can be made such that conclusions regarding the genetic interaction of ketoconazole and the surface residue(s) on PXR are feasible. Thus, we developed a high throughput two-hybrid yeast screen of PXR mutants interacting with its coactivator, SRC-1. Using this approach, in which the yeast was modified to accommodate the study of the antifungal drug, ketoconazole, we could demonstrate specific mutations on PXR enriched in clones unable to bind to ketoconazole. By reverse logic, we conclude that the original residues are direct interaction residues with ketoconazole. This assay represents a novel, tractable genetic assay to screen for antagonist binding sites on nuclear receptor surfaces. This assay could be applied to any drug regardless of its cytotoxic potential to yeast as well as to cellular protein(s) that cannot be studied using standard structural biology or proteomic based methods. Potential pitfalls include interpretation of data (complementary methods useful), reliance on single Y2H method, expertise in handling yeast or performing yeast two-hybrid assays, and assay optimization.

Ketoconazole binds to and antagonizes Pregnane X Receptor (PXR) activation. Yeast high throughput screens of PXR mutants define a unique region for ketoconazole binding. This yeast-based genetic method discovers novel nuclear receptor interactions with ligands that associate with surface binding sites.

포유류의 핵 수용체 잔류를 확인하기 위해 효모 두 하이브리드 시스템을 반전하는 리간드 및 / 또는 길항제와 상호 작용

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq has been used for mapping protein-DNA interactions and allocating histones modifications. The procedure is tedious and time consuming, and one of the major limitations is the requirement for high amounts of starting material, usually millions of cells. Automation of chromatin immunoprecipitation assays is possible when the procedure is based on the use of magnetic beads. Successful automated protocols of chromatin immunoprecipitation and library preparation have been specifically designed on a commercially available robotic liquid handling system dedicated mainly to automate epigenetic assays. First, validation of automated ChIP-seq assays using antibodies directed against various histone modifications was shown, followed by optimization of the automated protocols to perform chromatin immunoprecipitation and library preparation starting with low cell numbers. The goal of these experiments is to provide a valuable tool for future epigenetic analysis of specific cell types, sub-populations, and biopsy samples.

Methods for mapping in vivo protein-DNA interactions are becoming crucial for every aspect of genomic research but they are laborious, costly, and time consuming. Here a commercially available robotic liquid handling system that automates chromatin immunoprecipitation for mapping in vivo protein-DNA interactions with limited amounts of cells is presented.

칩 서열 실험을 자동화하면 10,000 헬라 세포에 성적인 프로필을 생성합니다

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebrafish의에서 콩팥 세포 독소 미세 주입은 급성 신장 손상을 모델링하기

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...