기술 지원에 대해 Roberta Migliore에게 감사드립니다. 이러한 결과로 이어지는 연구는 IG2016-ID.18443 프로젝트 – P.I. Marchesi Federica에 따라 Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC)로부터 자금을 지원 받았습니다. 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.

등록 된 모든 환자에 대해 말초 혈액과 췌장액은 기관의 윤리위원회가 승인 한 프로토콜에 따라 수술시 수집되었습니다. 모든 환자는 생물학적 표본 및 임상 데이터 수집을 포함하여 사전 동의서에 서명 한 후 연구에 등록되었습니다. 이 연구는 기관의 윤리위원회 (프로토콜 번호 ICH-595, 2009 년 5 월 승인 발행)의 승인을 받았습니다. 마우스와 그 관리와 관련된 절차는 EU 및 기관 지침 (프로토콜 ID 121 / 2016-PR)을 준수했습니다.
1. 췌장액의 분리
참고: 췌장액의 회수는 전문 췌장 외과 의사에 의한 췌장 절제술(예: 췌장 십이지장 절제술, 전체 췌장 절제술, 원위 췌장 절제술)의 공개 절차의 맥락에서 실행됩니다.
<ol><li>환자 선택<ol><li>개방 췌장 절제술로 예정된 환자를 절차를 고려하십시오.</li>
		<li>주 췌관 크기가 췌장액 회수를 허용하기에 충분하다고 판단되는 경우 포함을 확인하십시오. 주 췌관 직경의 최소 한계는 조영제 강화 CT 영상에서 2mm로 간주됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>췌장액 검색 계획에 도움이 되는 조영제 CT 영상에서 췌관의 수술 전 연구<ol><li>췌장 목 수준에서 글 랜드 내의 주 췌장 덕트를 3 차원 적으로 국소화하십시오 : 단면 슬라이드의 전방, 상부 및 하부 췌장 마진, 관상 및 시상 렌더링에서 주 췌장 덕트의 거리를 측정합니다. 수술실에 도착하면이 측정 값을 사용하여 Wirsung 덕트를 캐뉼레이션하고 췌장액을 회수하기 위해 췌장을 뚫을 정확한 위치를 근사화하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>재료 준비<ol><li>멸균 물질: 25G 바늘 1개와 3mL 주사기 1개의 멸균 봉투를 열고 스크럽 간호사의 협조를 받아 멸균 필드에 배치합니다.</li>
		<li>멸균되지 않은 물질: 유체 보관을 위해 수술실에 3mL K2EDTA 진공 시험관을 준비하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>환자의 준비<ol><li>환자를 수술실 침대에 놓습니다. 레미 펜타닐, 세보 란 및 로쿠로 늄을 사용하여 혼합 전신 마취를 유도 한 다음 삽관하고 환자 환기를 시작하십시오. 환자를 앙와위 욕창에 놓고 오른팔을 몸에 집어넣고 왼팔을 90°까지 납치하여 암보드에 고정합니다.</li>
		<li>절개 부위에서 복부의 피부를 소독하십시오. 환자를 드레이핑하는 복부에 멸균 장을 만들고 유지하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>수술<ol><li>늑골 하 절개를 수행하고 복강에 접근하십시오. 장기 노출을 위해 Rochard 복부 수축을 배치합니다.</li>
		<li>Kocher 기동, 위 인대 개방, 췌장의 상하 경계를 따라 후 복막 조직을 절개하여 췌장 목과 후방에 위치한 상 장간막 정맥 사이에 해부 평면을 만드는 췌장을 노출하고 동원합니다.</li>
		<li>췌장이 동원되고 노출되면 췌장 목을 절개하기 전에 췌장액 금단을 진행하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>췌장 덕트의 식별 및 위치 파악<ol><li>영상에서 측정한 값을 사용하여 췌관의 위치를 추정한 다음 췌장의 앞쪽 표면을 촉지하여 정확한 위치를 식별합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>췌장액 수집<ol><li>췌장 머리와 십이지장을 아래에서 잡고 왼손으로 들어 올려 췌관의 위치를 첫 번째 숫자로 표시하십시오.</li>
		<li>3G 바늘이 장착된 상태에서 25mL 주사기의 오른손으로 잡습니다.</li>
		<li>오른손을 사용하여 왼쪽 엄지 손가락 바로 말단의 췌장에 바늘을 삽입하십시오. 수술 전 측정과 덕트 벽을 관통했다는 인식을 기반으로 바늘의 침투 깊이와 경사도를 결정하십시오.</li>
		<li>주사기로 주스를 빼냅니다. 주스를 회수 할 수없는 경우 췌관을 캐뉼레이션하기 위해 바늘을 네 방향으로 재배치하십시오.</li>
		<li>췌장액이 회수되면 멸균 필드 외부로 옮겨 3mL K2EDTA 진공 시험관으로 옮깁니다. 샘플이 실험실로 옮겨질 때까지 4°C를 유지하고 가능한 한 빨리 추가 처리를 진행합니다. 알림: 이 절차로 회수할 수 있는 췌장액의 양은 경험상 약 0.2mL에서 3mL까지 매우 다양합니다. 회수되는 주스의 양은 환자에 따라 크게 달라집니다 : Wirsung 덕트의 크기와 췌장의 기능 상태 (기능 대 위축선). 우리의 경험상 검색되는 췌장액의 양을 늘리는 데 사용할 수있는 편의는 없습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 췌장액 가공
<ol><li>췌장액을 400 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 세포나 파편을 제거합니다. 알림: 췌장액은 원심 분리 전에 투명하고 투명해야합니다. 수술 중 혈액 오염이 때때로 발생하여 샘플이 더 어둡고 붉게 보일 수 있습니다. 이러한 샘플을 추가 분석에서 제외하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>상청액을 회수하고, 분취량을 추가 분석할 때까지 -80°C에서 저장한다.</li>
</ol>3. 피하 종양의 유도
참고: 뮤린 Panc02 및 DT6606 세포주는앞서 설명한 바와 같이 각각 로렌조 피에몬티 교수(이탈리아 밀라노 산 라파엘레 당뇨병 연구소) 및 프란체스코 노벨리 교수(이탈리아 토리노의 실험 연구 및 의학 연구 센터)로부터 수득하였다.
<ol><li>종양 세포의 성장<ol><li>10% 태아 소 혈청(FBS), 2mM L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 항생제를 포함하는 로스웰 파크 기념 연구소(RPMI) 1640 배지에서 Panc02 및 DT6606 세포를 배양합니다.</li>
		<li>종양 주입 1-2주 전에 동결된 세포를 해동하고, 세포주의 성장 속도에 따라.</li>
		<li>멸균 조건에서 5%CO2 및 95% 습도로 37°C에서 세포를 성장시킨다.</li>
		<li>0.025% 트립신/EDTA 용액으로 세포를 분리하여 80% 컨플루언시에 도달하면 37°C에서 5분 동안 분리하고 원심분리로 트립신을 제거합니다. 참고: DT6606은 LSL-KrasG12D-Pdx1-Cre 마우스에서 파생된 불멸화되지 않은 기본 세포이며 원래 특성을 유지하기 위해 생체 내 주사 전에 3회 이상 계대배양해서는 안 됩니다. 주사 7-10 일 전에 DT6606 세포를 해동하는 것이 좋습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>생체 내 종양 세포 주입
	<ol><li>세포를 트립신 화하고 (3.1.4 단계 참조) 인산염 완충 식염수 (PBS)로 한 번 세척하십시오. 원심분리로 PBS를 제거하고 계수하기 전에 새로운 PBS에 세포를 재현탁합니다.</li>
		<li>세포를 세고 0.5-1 x 10 6cells/100 μL의 최종 농도가 되도록 PBS에 0.5-1 x 107 cells/mL의 농도로 재현탁시켜 각 마우스에 주입합니다. 세포를 과도하게 준비하십시오. 절차가 끝날 때까지 세포를 4 ° C 또는 얼음 위에 보관하십시오.</li>
		<li>동물(8주령 암컷 C57BL/6J 마우스)을 다른 세포주 또는 처리에 따라 다른 케이지에 그룹화합니다.</li>
		<li>동물을 수동으로 제지하고 케타민 (80 mg / kg)과 자일 라진 (10 mg / kg)의 혼합물을 사용하거나 현지에서 승인 된 절차에 따라 마취하십시오.</li>
		<li>전기 면도기로 주사 부위 (일반적으로 다리 위의 측면)를 면도하고 알코올로 주사 부위를 조심스럽게 청소하십시오.</li>
		<li>1mL 주사기로 세포 현탁액을 위아래로 피펫팅하고 피스톤을 위아래로 움직여 기포를 제거합니다. 25G 바늘을 주사기에 부착하고 세포 현탁액이 바늘 구멍에 도달할 때까지 피스톤을 위쪽으로 밉니다.</li>
		<li>평평한 끝 집게로 옆구리의 피부를 꼬집고 복강이나 근육계에 구멍을 뚫지 않고 집게 사이의 피부 주름 바닥에 바늘을 조심스럽게 삽입하십시오. 바늘의 올바른 위치를 확인하려면 바늘 끝을 피부 아래로 옆으로 부드럽게 움직여보십시오. 바늘은 자유롭게 움직여야합니다.</li>
		<li>100μL의 세포 현탁액 (0.5-1 x 106 세포 포함)을 천천히 주입하고 주사 부위를 몇 초 동안 부드럽게 고정하고 옆으로 움직이지 않고 바늘을 천천히 빼냅니다.</li>
		<li>마우스를 케이지로 되돌리고 마취 후 회복을 모니터링하십시오.</li>
		<li>3-4 주 동안 캘리퍼스를 사용하여 종양 성장을 확인하십시오. 종양이CO2를 사용하여 또는 국부적으로 승인된 절차에 따라 대략 0.5-1cm3에 도달할 때 동물을 안락사시킨다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 종양 간질 액 (TIF)의 분리
<ol><li>피하 종양의 절제<ol><li>종이 테이프로 동물의 팔다리를 막고 알코올로 피부를 닦으십시오. 복막에서 피부를 분리하고 팔다리까지 가기 위해 복부에서 피부를 잘라냅니다. 가위, 클램프 및 결국 메스의 도움으로 옆구리의 피부 아래에서 자란 종양을 절제하십시오.</li>
		<li>종양의 무게를 측정하고 TIF가 분리 될 때까지 얼음 위의 깨끗한 튜브에 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>원심분리에 의한 TIF의 분리<ol><li>종양을 반으로 자르고 PBS로 두 부분을 빠르게 헹구고 여과지로 부드럽게 닦아 과도한 PBS를 제거합니다. 종양에서 증발을 피하기 위해 가능한 한 빨리이 단계를 수행하십시오.</li>
		<li>종양을 50mL 원추형 튜브 위에 부착된 20μm 나일론 세포 여과기로 즉시 옮깁니다.</li>
		<li>튜브를 400 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 참고: 이 저속 원심분리는 세포 내 구획에 의한 TIF의 오염을 방지하는 세포 무결성을 보존합니다. 세포내 함량 누출은 예를 들어 리보솜 단백질25와 같은 세포내 하우스키핑 단백질의 존재를 평가함으로써 다운스트림 용도에서 시험될 수 있다.</li>
		<li>튜브 바닥에서 TIF를 회수하고, 최종적으로 분취하고, 즉시 드라이 아이스에서 동결시키고 추가 분석이 있을 때까지 -80°C에서 보관합니다. 선택 사항: 수행할 다운스트림 단백질체학 분석에 기초하여, 특정 분자의 분해를 피하기 위해 프로테아제 억제제 칵테일로 PBS에서 샘플을 희석한다. 참고: 종양의 구성에 따라 어떤 경우에는 매우 작은 종양이 체액을 생성하지 않습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>용리에 의한 TIF의 분리<ol><li>가위 또는 메스로 종양을 작은 조각 (≈1-3 mm3)으로 자르고 차가운 PBS로 조심스럽게 헹굽니다. 알림: 이 단계에서는 셀 손상을 방지하기 위해 빠르게 작업하고 최소한의 조작을 수행하는 것이 매우 중요합니다.</li>
		<li>종양 조각을 1.5mL 튜브로 옮기고 프로테아제 억제제 칵테일과 함께 500μL의 PBS를 추가하여 분석물의 분해를 방지합니다. 37°C 및 5%CO2에서 1시간 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>상청액을 회수하여 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 4°C에서 5분 동안 1,000 x g 로 원심분리하여 샘플에서 세포를 제거합니다.</li>
		<li>상청액을 새 튜브로 옮기고 4°C에서 8분 동안 2,000 x g 에서 다시 원심분리합니다.</li>
		<li>상청액을 새 튜브로 옮기고 4°C에서 30분 동안 20,000 x g 로 다시 원심분리하여 이물질을 제거합니다. 상청액을 회수하십시오. TIF 샘플을 즉시 분취하고, 드라이아이스 상에서 동결시키고, 추가 분석이 있을 때까지 -80°C에서 저장한다.</li>
	</ol></li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 연구에서 우리는 대부분 탐험되지 않은 유체 생검 인 췌장액을 수술 중 수집하는 기술을 설명했습니다. 우리는 최근에 췌장액이 질병12의 대사 마커의 원천으로 이용 될 수 있음을 보여주었습니다. 혈액 5,6,7, 소변8 및 타액9와 같은 다른 액체 생검에 대한 대사체 분석은 ...

췌장 관 선암 (PDAC)은 가장 공격적인 종양 중 하나이며 곧 두 번째 주요 사망 원인이 될 것입니다 1,2,3. 면역 억제 미세 환경과 면역 요법 프로토콜4에 대한 무반응으로 잘 알려져 있습니다. 현재 외과적 절제술은 여전히 PDAC의 유일한 치료 옵션이지만 조기 재발 및 수술 후 합병증의 빈도가 높습니다. 고급 단계까지 특정 증상이 없으면 조기 진단이 불가능하여 질병의 종말에 기여합니다. 또한, PDAC와 다른 양성 췌장 병리 사이의 증상의 중복은 현재의 진단 전략으로 신속하고 신뢰할 수있는 진단의 달성을 방해 할 수 있습니다. 특정 췌장 병리와 관련된 변수의 식별은 수술 의사 결정 과정을 용이하게하고 환자 프로파일 링을 개선 할 수 있습니다.
바이오마커 발견에서 유망한 결과는 혈액 5,6,7, 소변8, 타액 9 및 췌장액10,11,12와 같이 쉽게 접근할 수 있는 체액을 사용하여 달성되었습니다. 많은 연구에서 PDAC와 다른 양성 췌장 질환을 구별할 수 있는 후보 분자 또는 시그니처를 식별하기 위해 게놈, 단백질체학 및 대사체학 기술과 같은 포괄적인 "오믹스" 접근 방식을 활용했습니다. 우리는 최근에 상대적으로 탐험되지 않은 체액인 췌장액을 사용하여 뚜렷한 임상 프로필을 가진 환자의 대사 시그니처를 식별할 수 있음을 입증했습니다12. 췌장액은 단백질이 풍부한 액체로 췌장 덕트 세포의 분비물을 축적하여 주 췌장 덕트로 흐른 다음 주 담관으로 흐릅니다. 췌장과의 근접성으로 인해 종양 덩어리에 의해 유도 된 미세 환경 섭동 (그림 1)에 크게 영향을받을 수 있으므로 혈액이나 소변 또는 조직 기반 프로파일 링보다 더 유익합니다. 여러 연구에서 세포학적 분석13, 질량분석법14,15에 의해 수행된 단백질체학적 분석, K-ras 및 p53 돌연변이와 같은 유전적 및 후성유전학적 마커의 평가16,17, DNA 메틸화18 및 miRNA의 변화19를 포함한 다양한 접근 방식을 사용하여 질병의 새로운 바이오마커를 식별하는 췌장액의 잠재력을 탐구했습니다. . 기술적으로, 췌장액은 수술 중 또는 내시경 초음파, 역행 담관 - 췌장 조영술과 같은 최소 침습적 절차 또는 십이지장 주스 분비물20의 내시경 수집에 의해 수집 될 수있다. 췌장액 성분이 사용 된 수집 기술에 의해 어느 정도 영향을 받는지는 아직 명확하지 않습니다. 우리는 여기에서 수술 중 수집 절차를 설명하고 췌장액이 PDAC 바이오마커의 귀중한 공급원이 될 수 있음을 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61687/61687fig01.jpg"> 그림 1: 췌장액 수집의 개략적 표현. (A) 췌장액이 췌관으로 분비되고 수술 중 수집되는 것을 묘사하는 개략적 표현. 삽입물은 종양 미세 환경의 클로즈업을 보여줍니다 : 췌장액은 췌장 덕트의 종양 및 기질 세포에 의해 방출되는 분자를 수집합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61687/61687fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
PDAC의 유전 및 동종 마우스 모델에서 췌장액 수집은 전임상 기계 론적 연구에서이 생체 유체를 활용하는 관점에서 높이 평가 될 것이다. 그러나이 절차는 기술적으로 매우 어려울 수 있으며 피하 종양과 같은 단순한 모델에는 적합하지 않습니다. 이러한 이유로 우리는 종양 간질 액 (TIF)을 췌장액의 대체 공급원으로 확인했는데, 이는 주변 섭동의 지표 역할을하는 유사한 특성 때문입니다. 간질 액 (IF)은 혈액 및 림프관 외부에서 발견되는 세포 외 액체이며, 조직 세포(21)를 목욕시킵니다. IF 조성물은 장기로의 혈액 순환과 국소 분비 모두에 의해 영향을받습니다. 사실, 주변 세포는 IF21에서 단백질을 적극적으로 생산하고 분비합니다. 간질은 주변 조직의 미세 환경 변화를 반영하므로 종양과 같은 여러 병리학 적 맥락에서 바이오 마커 발견을위한 귀중한 원천이 될 수 있습니다. TIF에서 국소 분비된 단백질의 고농도는 혈장22,23,24에서 예후 또는 진단적 바이오마커로서 시험될 후보 분자를 확인하는데 사용될 수 있다. 여러 연구에서 TIF가 질량 분석 기술23,24,25, 다중 ELISA 접근법26 및 microRNA 프로파일링 27과 같은 고처리량 단백질체학 접근법에 적합한 샘플임이 입증되었습니다.
종양에서 IF의 분리를 위해 몇 가지 접근법이 제안되었으며, 이는 생체 내 (모세관 한외 여과 28,29,30,31 및 미세 투석 32,33,34,35) 및 생체 외 방법 (조직 원심 분리22,36,37,38 및 조직 용출 39,40,41,42). 이러한 기술은43,44에서 광범위하게 검토되었습니다. 적절한 방법을 선택할 때는 다운스트림 분석 및 애플리케이션과 복구된 볼륨과 같은 문제를 고려해야 합니다. 우리는 최근에 두 개의 쥐 췌장 선암 세포주12에서 종양의 다른 대사 활성을 입증하기 위한 원리 증명으로 이 접근법을 사용했습니다. 문헌24,38에 기초하여, 우리는 세포 내 내용물로 인한 세포 파손 및 희석을 피하기 위해 저속 원심 분리 방법을 사용하기로 결정했습니다. TIF에서 포도당과 락테이트의 양은 모두 두 개의 상이한 세포주의 상이한 해당 특성을 반영하였다. 여기에서는 TIF 분리에 가장 일반적으로 사용되는 두 가지 방법인 조직 원심분리와 조직 용리에 대한 프로토콜을 자세히 설명합니다(그림 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61687/61687fig02.jpg"> 그림 2: 종양 간질액 분리 방법의 개략적 표현. 프로토콜에 상세히 기술된 기술, 즉 조직 원심분리(A) 및 조직 용출(B)의 개략도를 도시한 것이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61687/61687fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>GR616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>pluriSelect</td>
			<td>43-50020-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL K2EDTA vacutainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>06.20.12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable scalpel</td>
			<td>Medicom</td>
			<td>9000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Microtech</td>
			<td>MG10432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-tipped forceps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>06.00.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>34044100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB9006L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>02.04.09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA 1x</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraglutamine 100x</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E/U1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of proximal fluids to investigate the tumor microenvironment of pancreatic adenocarcinoma

췌장 선암종 (PDAC)은 암 관련 사망의 네 번째 주요 원인이며 곧 두 번째가 될 것입니다. 수술 전 감별 진단 및 환자 프로파일 링을 돕기 위해 특정 췌장 병리와 관련된 변수가 시급히 필요합니다. 췌장액은 상대적으로 탐험되지 않은 체액으로, 종양 부위와 가깝기 때문에 주변 조직의 변화를 반영합니다. 여기에서는 수술 중 수집 절차에 대해 자세히 설명합니다. 불행히도 췌장액 수집을 PDAC의 쥐 모델로 번역하여 기계 론적 연구를 수행하는 것은 기술적으로 매우 어렵습니다. 종양 간질 액 (TIF)은 종양 및 기질 세포를 목욕시키는 혈액 및 혈장 외부의 세포 외액입니다. 췌장액과 유사하게, 혈장에서 희석된 것으로 밝혀진 분자를 수집하고 농축하는 특성 때문에 TIF는 미세환경 변화의 지표 및 질병 관련 바이오마커의 귀중한 공급원으로 활용될 수 있습니다. TIF는 쉽게 접근할 수 없기 때문에, 그 분리를 위해 다양한 기술이 제안되었다. 여기서는 분리를 위한 간단하고 기술적으로 까다로운 두 가지 방법인 조직 원심분리와 조직 용출에 대해 설명합니다.

우리는 췌장염 (n = 2), 유두-팽대 종양 (n = 4), 신경 내분비 종양 (n = 2), 관 내 유두 점액 성 신 생물 (IPMN; n = 1) 12를 포함한 PDAC (n = 31) 및 기타 양성 췌장 질환 (비 PDAC, n = 9) 환자로부터 췌장액을 얻기 위해 위에서 설명한 절차를 따랐다. 그런 다음 췌장액 샘플을 핵자기 공명(1H-NMR)12을 사용하여 대사체 분석을 수행했습니다. 거대분자(예: 지단백질...

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Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

췌장액은 인간 췌장암에 대한 바이오마커의 귀중한 공급원입니다. 여기서는 수술 중 수집 절차 방법을 설명합니다. 쥐 모델에서 이 절차를 채택하는 문제를 극복하기 위해 대체 샘플인 종양 간질액을 제안하고 여기에서 분리를 위한 두 가지 프로토콜을 설명합니다.

췌장 선암의 종양 미세 환경을 조사하기위한 근위액 분리

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

isolation-proximal-fluids-to-investigate-tumor-microenvironment

Research

JoVE Journal

Cancer Research

3.2K 조회수.  Humanitas Clinical and Research Center-IRCCS. 췌장액은 인간 췌장암에 대한 바이오마커의 귀중한 공급원입니다. 여기서는 수술 중 수집 절차 방법을 설명합니다. 쥐 모델에서 이 절차를 채택하는 문제를 극복하기 위해 대체 샘플인 종양 간질액을 제안하고 여기에서 분리를 위한 두 가지 프로토콜을 설명합니다.

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Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, in the case that the KD of the protein of interest has a lethal effect on cells or the anticipated effect of the KD is time-dependent, unconditional KD methods are not appropriate. Conditional systems are more suitable in these cases and have been the subject of much interest. These include Ecdysone-inducible overexpression systems, Cytochrome P-450 induction system1, and the tetracycline regulated gene expression systems. 
The tetracycline regulated gene expression system enables reversible control over protein expression by induction of shRNA expression in the presence of tetracycline. In this protocol, we present an experimental design using functional Tet-ON system in human cancer cell lines for conditional regulation of gene expression. We then demonstrate the use of this system in the study of tumor cell-monocyte interaction.

This protocol serves as a scheme for setting up a functional Tet-ON system in cancer cell lines and its subsequent use, in particular for studying the role of tumor cell-derived proteins in recruitment of monocytes/macrophages to the tumor microenvironment.

암 세포 선 종양 Microenvironment에 Monocytes/대 식 세포의 모집 연구에서 유전자 발현의 조건부 최저

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

연구

암 연구학

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly its immune-components, is vital to the prognosis and prediction of treatment outcomes, especially those of immunotherapy. TME immune-components are composed of different subsets of tumor-infiltrating immune cells assessable by multi-color FACS. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is among the deadliest malignances lacking good treatment options, thus an urgent and unmet medical need. One important reason for its non-responsiveness to various therapies (chemo-, targeted, I/O) has been its abundant TME, consisting of fibroblasts and leukocytes that protect tumor cells from these therapies. Orthotopically implanted PDAC is believed to more accurately recapture the TME of human pancreatic cancers than conventional subcutaneous (SC) models.
Homograft tumors (KPC) are transplants of mouse spontaneous PDAC originating from genetically engineered KPC-mice (KrasG12D/+/P53-/-/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). The primary tumor tissue is cut into small fragments (~2 mm3) and transplanted subcutaneously (SC) to the syngeneic recipients (C57BL/6, 7&#8211;9 weeks old). The homografts were then surgically orthotopically transplanted onto the pancreas of new C57BL/6 mice, along with SC-implantation, which reached tumor volumes of 300&#8211;1,000 mm3 by 17 days. Only tumors of 400&#8211;600 mm3 were harvested per approved autopsy procedure and cleaned to remove the adjacent non-tumor tissues. They were dissociated per protocol using a tissue dissociator into single-cell suspensions, followed by staining with designated panels of fluorescently-labeled antibodies for various markers of different immune cells (lymphoid, myeloid and NK, DCs). The stained samples were analyzed using multi-color FACS to determine numbers of immune cells of different lineages, as well as their relative percentage within tumors. The immune profiles of orthotopic tumors were then compared to those of SC tumors. The preliminary data demonstrated significantly elevated infiltrating TILs/TAMs in tumors over the pancreas, and higher B-cell infiltration into orthotopic rather than SC tumors.

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

The experimental procedure on the immunophenotyping of murine orthotopic PDAC homografts aims at profiling the tumor immuno-microenvironment. Tumors are orthotopically implanted via surgery. Tumors of 200&#8211;600 mm3 in size were harvested and dissociated to prepare single-cell suspensions, followed by multi-immune marker FACS analysis using different fluorescently-labeled antibodies.

Immunophenotyping Orthotopic Homograft (Syngeneic) Murine 기본 KPC 췌 장 Ductal 선 암의 Cytometry로의

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the 3-dimensional (3D) modeling of this disease have been described. Patient-derived organoid (PDO) models can be isolated from both surgical specimens as well as small biopsies and form rapidly in culture. Importantly, organoid models preserve the pathogenic genetic alterations detected in the patient&#39;s tumor and are predictive of the patient&#39;s treatment response, thus enabling translational studies. Here, we provide comprehensive protocols for adapting tissue culture workflow to study 3D, matrix embedded, organoid models. We detail methods and considerations for isolating and propagating primary PDAC organoids. Furthermore, we describe how bespoke organoid media is prepared and quality controlled in the laboratory. Finally, we describe assays for downstream characterization of the organoid models such as isolation of nucleic acids (DNA and RNA), and drug testing. Importantly we provide critical considerations for implementing organoid methodology in a research laboratory.

Patient-derived organoid cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma are a rapidly established 3-dimensional model that represent epithelial tumor cell compartments with high fidelity, enabling translational research into this lethal malignancy. Here, we provide detailed methods to establish and propagate organoids as well as to perform relevant biological assays using these models.

환자 유래 췌장 선암 조직형 모델의 격리 및 특성 분석

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the limitations of current treatments, as the majority of patients do not respond to immunotherapy. Development of accurate preclinical models to quickly identify novel and effective therapeutic combinations are critical to address this unmet clinical need. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) is a canonical example of an immune checkpoint blockade resistant tumor with only 2% of patients responding to immunotherapy. The genetically engineered KrasG12D+/-;Trp53R172H+/-;Pdx-1 Cre (KPC) mouse model of PDA recapitulates human disease and is a valuable tool for assessing therapies for immunotherapy resistant in the preclinical setting, but time to tumor onset is highly variable. Surgical orthotopic tumor implantation models of PDA maintain the immunobiological hallmarks of the KPC tissue-specific tumor microenvironment (TME) but require a time-intensive procedure and introduce aberrant inflammation. Here, we use an ultrasound-guided orthotopic tumor implantation model (UG-OTIM) to non-invasively inject KPC-derived PDA cell lines directly into the mouse pancreas. UG-OTIM tumors grow in the endogenous tissue site, faithfully recapitulate histological features of the PDA TME, and reach enrollment-sized tumors for preclinical studies by four weeks after injection with minimal seeding on the peritoneal wall. The UG-OTIM system described here is a rapid and reproducible tumor model that may allow for high throughput analysis of novel therapeutic combinations in the murine PDA TME.

We describe a protocol for the ultrasound guided implantation of murine-derived pancreatic ductal adenocarcinoma cell lines directly into the native tumor site. This approach resulted in pancreatic tumors detectable by ultrasound scanning within 2-4 weeks of injection, and significantly reduced the proportion tumor cell seeding on the peritoneal wall as compared to surgical orthotopic implantation.

뮤린 췌장 연성 선암의 초음파 유도 정형 외 이식

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great significance for tumor research. Currently, several techniques are used for the identification and purification of CSCs from tumor tissues and tumor cell lines. Separation and analysis of side population (SP) cells are two of the commonly used methods. The methods rely on the ability of CSCs to rapidly expel fluorescent dyes, such as Hoechst 33342. The efflux of the dye is associated with the ATP-binding cassette (ABC) transporters and can be inhibited by ABC transporter inhibitors. Methods for staining cultured tumor cells with Hoechst 33342 and analyzing the proportion of their SP cells by flow cytometry are described. This assay is convenient, fast, and cost-effective. Data generated in this assay can contribute to a better understanding of the effect of genes or other extracellular and intracellular signals on the stemness properties of tumor cells.

A convenient, fast, and cost-effective method to measure the proportion of side population cells in solid tumor cell lines is presented.

고형 종양 세포주에서 측면 인구의 분석

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role of CAFs in the tumor microenvironment can be helpful for understanding the functional importance of fibroblasts, fibroblasts from different tissues, and specific genetic factors in fibroblasts. Mouse models are essential for understanding the contributors to tumor growth and progression in an in vivo context. Here, a protocol in which cancer cells are mixed with fibroblasts and introduced into mice to develop tumors is provided. Tumor sizes over time and final tumor weights are determined and compared among groups. The protocol described can provide more insight into the functional role of CAFs in tumor growth and progression.

A protocol to co-inject cancer cells and fibroblasts and monitor tumor growth over time is provided. This protocol can be used to understand the molecular basis for the role of fibroblasts as regulators of tumor growth.

종양 성장에서 암 관련 섬유아세포의 역할을 조사하기 위한 마우스 모델

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell populations. To characterize proteome-level variation and tumor heterogeneity at scale, high-throughput methods are needed to selectively isolate discrete cellular populations in solid tumor malignancies. This protocol describes a high-throughput workflow, enabled by artificial intelligence (AI), that segments images of hematoxylin and eosin (H&#38;E)-stained, thin tissue sections into pathology-confirmed regions of interest for selective harvest of histology-resolved cell populations using laser microdissection (LMD). This strategy includes a novel algorithm enabling the transfer of regions denoting cell populations of interest, annotated using digital image software, directly to laser microscopes, thus enabling more facile collections. Successful implementation of this workflow was performed, demonstrating the utility of this harmonized method to selectively harvest tumor cell populations from the TME for quantitative, multiplexed proteomic analysis by high-resolution mass spectrometry. This strategy fully integrates with routine histopathology review, leveraging digital image analysis to support enrichment of cellular populations of interest and is fully generalizable, enabling harmonized harvests of cell populations from the TME for multiomic analyses.

This protocol describes a high-throughput workflow for artificial intelligence-driven segmentation of pathology-confirmed regions of interest from stained, thin tissue section images for enrichment of histology-resolved cell populations using laser microdissection. This strategy includes a novel algorithm enabling the transfer of demarcations denoting cell populations of interest directly to laser microscopes.

종양 미세환경의 미세스케일 프로테오믹 분석을 위한 산업화된 인공 지능 유도 레이저 미세 해부

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...

Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features of a unique and convenient model system. As highly proliferative cells are more susceptible to radiation-induced DNA damage, zebrafish embryos are a front-line in vivo model in radiation research. In addition, this model projects the effect of radiation and different drugs within a short time, along with major biological events and associated responses. Several cancer studies have used zebrafish, and this protocol is based on the use of radiation modifiers in the context of radiotherapy and cancer. This method can be readily used to validate the effects of different drugs on irradiated and control (non-irradiated) embryos, thus identifying drugs as radio sensitizing or protective drugs. Although this methodology is used in most drug screening experiments, the details of the experiment and the toxicity assessment with the background of X-ray radiation exposure are limited or only briefly addressed, making it difficult to perform. This protocol addresses this issue and discusses the procedure and toxicity evaluation with a detailed illustration. The procedure describes a simple approach for using zebrafish embryos for radiation studies and radiation-based drug screening with much reliability and reproducibility.

The zebrafish has recently been exploited as a model to validate potential radiation modifiers. The present protocol describes the detailed steps to use zebrafish embryos for radiation-based screening experiments and some observational approaches to evaluate the effect of different treatments and radiation.

잠재적인 방사능 감작제 또는 보호제를 평가하기 위한 모델로서의 제브라피시 유충

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...

종양 면역 환경 매핑: 심층 멀티플렉스 IHC 분석 프로토콜

Multiplex Immunohistochemical Analysis of the Spatial Immune Cell Landscape of the Tumor Microenvironment

The immune cell landscape of the tumor microenvironment potentially contains information for the discovery of prognostic and predictive biomarkers. Multiplex immunohistochemistry is a valuable tool to visualize and identify different types of immune cells in tumor tissues while retaining its spatial information. Here we provide detailed protocols to analyze lymphocyte, myeloid, and dendritic cell populations in tissue sections. Starting from cutting formalin-fixed paraffin-embedded sections, automatic multiplex staining procedures on an automated platform, scanning of the slides on a multispectral imaging microscope, to the analysis of images using an in-house-developed machine learning algorithm ImmuNet. These protocols can be applied to a variety of tumor specimens by simply switching tumor markers to analyze immune cells in different compartments of the sample (tumor versus invasive margin) and apply nearest-neighbor analysis. This analysis is not limited to tumor samples but can also be applied to other (non-)pathogenic tissues. Improvements to the equipment and workflow over the past few years have significantly shortened throughput times, which facilitates the future application of this procedure in the diagnostic setting.

저자 스포트라이트: 종양의 면역 세포 환경에 대한 통찰력 확보

This protocol describes in detail how immune cell characterization of the tumor microenvironment using multiplex immunohistochemistry is carried out.

종양 미세환경의 공간 면역 세포 풍경에 대한 다중 면역조직화학적 분석

The immune cell landscape of the tumor microenvironment potentially contains information for the discovery of prognostic and predictive biomarkers. ...