측면 집단 세포의 분석은 종양 조직 및 종양 세포주로부터 암 줄기 세포를 격리하고 식별하는 데 일반적으로 사용되는 방법 중 하나입니다. 이 분석은 편리하고 빠르며 비용 효율적입니다. 이 방법은 종양 세포의 줄기 속성에 유전자 또는 그밖 세포외 및 세포내 신호의 효력의 더 나은 이해에 기여할 수 있습니다.
많은 요인이 이 분석에서 SP 세포의 백분율에 영향을 미칠 수 있으므로 공식적인 실험 전에 적절한 조건을 탐색하는 것이 중요합니다. 6웰 플레이트에 종양 세포를 종자, 5 %의 이산화탄소와 함께 공급 37도 섭씨 인큐베이터에서 그들을 배양. 세포 밀도가 약 90%에 도달하면 배양 배지를 흡인하고, PBS의 3밀리리터로 세포를 두 번 세척한다.
그런 다음 각 웰에 0.25 %의 트립신-EDTA의 500 마이크로 리터를 추가하고 1 ~ 3 분 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 부드럽게 세포를 분리하기 위해 접시를 누른 다음, 각 우물에 2 %의 FBS로 보충 된 PBS의 3 밀리리터를 추가하고 세포를 위아래로 피펫하여 세포 덩어리를 분산시십시오. 현미경의 밑에 세포 현탁액을 검사합니다.
세포 덩어리가 존재하는 경우, 70 마이크로 미터 여과기를 통해 서스펜션을 전달합니다. 세포를 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고, 원심분리기는 5분 동안 200배 g로 전달합니다. 상체를 제거하고 2 %의 FBS로 보충 된 PBS의 3 밀리리터에서 세포를 다시 일시 중지하여 세포를 3 ~ 5 번 배 위아래로 피펫하여 혼합합니다.
혈종계를 사용하여 현미경의 밑에 세포를 계산하고, 밀리리터 당 6 개의 세포에 10의 최종 농도로 2%FPS로 보충된 PBS에서 그(것)들을 희석합니다. 5밀리리터, 폴리스티렌, 라운드 하단 테스트 튜브 2개를 준비하고 각 튜브에 셀 서스펜션 1밀리리터를 추가합니다. 한 튜브를 테스트 튜브로, 다른 튜브를 차단제 제어 튜브로 라벨을 부착합니다.
적절한 농도로 희석하여 차단제의 용액을 준비합니다. 블로커 컨트롤 튜브에 넣고 잘 섞은 다음 37°C에서 30분간 튜브를 배양합니다. 10분마다 튜브를 흔들어 줍니다.
Hoechst 33342의 용액을 적절한 농도로 희석하여 준비하십시오. 테스트 튜브 및 차단제 제어 튜브에 별도로 추가하고 잘 섞은 다음 60 분 동안 섭씨 37도에서 튜브를 배양합니다. 10분마다 튜브를 흔들어 줍니다.
인큐베이션 후, 세포를 200배, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리한 다음, 수퍼나티를 조심스럽게 흡인시합니다. 2%의 FBS로 보충된 얼음 감기 PBS의 1밀리리터로 각 튜브의 세포를 다시 중단한 다음 세포를 위아래로 섞어 냅니다. 각 튜브에 밀리리터 당 1 밀리그램 프로피듐 요오드 또는 PI의 마이크로리터 1개를 넣고 혼합합니다.
흐름 사이토미터 소프트웨어에서 매개 변수 탭을 클릭합니다. 먼저 FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red 및 PI의 매개 변수를 각각 선택합니다. 둘째, PI 매개 변수에 대한 로그자리믹 축척을 선택합니다.
마지막으로 FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red 및 PI 매개변수에 대한 영역 및 너비 저울을 각각 선택합니다. 먼저 테스트 튜브에서 세포를 실행한 다음 동일한 전압과 게이트를 사용하여 차단기 제어 관에서 셀을 실행합니다. 각 샘플에서 20~100, 000개의 이벤트를 수집하여 SP 셀의 백분율을 분석합니다.
이 방법은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포주에서 SP 세포의 비율을 검출하기 위해 사용되었다. FSC-A 대 PI-A의 도트 플롯은 죽은 세포, 세포 파편 및 PI 음성 세포의 주요 집단의 인구를 보여주었으며, 이는 추가 분석을 거쳤습니다. FSC-A대 점도플롯에서 게이트된 단일 세포 집단과 SSC-A 대 SSC-A의 도트 플롯은 치료되지 않은 세포에서 약 0.9%, 레서핀으로 치료된 세포에서 약 0.09%였던 SP 세포의 비율을 분석하는 데 사용되었다.
Hoechst 33342의 상이한 염색 농도는 MDA-MB-435 세포에서 시험되었고, 밀리리터당 2마이크로그램이 SP 분석을 위해 최적이라고 판단되었다. 낮은 농도는 SP 세포를 다른 집단과 구별하기 어렵게 만들었으며, 높은 농도로 인해 SP 세포가 사라지게 되었습니다. 베라파밀 과 레서핀은 MDA-MB-435 세포에 대한 적절한 차단제를 결정하기 위해 시험되었다.
세포의 대략 0.4%는 verapamil 처리 후에 염료를 추방했습니다, 그러나 비율은 reserpine 처리 후에 대략 0.1%로 떨어졌습니다, reserpine이 이 세포주에 더 적합한 차단제이다는 것을 보여주는. 이 프로토콜은 또한 STAT3 활성제 colivelin로 처리된 A549 인간 폐 선암 세포및 FRA1 억제제 SKLB816으로 취급된 T47D 인간 유방암 세포에서 SP 세포의 비율을 결정하기 위하여 이용되었습니다. 이 분석법은 암 줄기 세포의 기능에 대한 신호 경로의 규제 효과에 대한 단서를 제공하고 궁극적으로 종양의 표적 치료를 안내 할 수있는 새로운 메커니즘의 발견을 용이하게합니다.
