이 연구는 보조금 번호 JP20am0101077에 따라 AMED의 약물 발견 및 생명 과학 연구 지원을 위한 플랫폼 프로젝트(혁신적인 약물 발견 및 생명 과학 연구(BINDS) 지원을 위한 기반)의 지원을 받았습니다. 이 작업은 JSPS KAKENHI 보조금 번호 20K05709에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

1. pEU 발현 플라스미드의 제조
참고: pEU 발현 플라스미드는 단편에서 시작 코돈, 표적 막 단백질의 개방 판독 프레임 및 정지 코돈을 포함해야 합니다( 그림 1 참조). 필요한 경우 적절한 위치에 검출/정제 태그 시퀀스를 추가합니다. 제한 효소 소화 또는 원활한 클로닝은 서브클로닝에 적용할 수 있습니다. 여기서는 원활한 복제 방법을 사용하는 프로토콜에 대해 설명합니다.
<ol><li>삽입 DNA 단편을 준비하십시오.<ol><li>cDNA 주형, 프라이머 1 및 프라이머 2를 사용하여 PCR에 의해 관심 유전자를 증폭한다. 프라이머 1 및 프라이머 2는 원활한 클로닝을 위해 각각 15bp 중첩을 포함합니다( 재료 표 참조). 참고: 세포의 성숙 단백질에서 처리 및 제거될 서열(예: 신호 서열)을 포함하지 마십시오. 합성된 단백질의 처리는 밀 무세포 시스템에서는 수행되지 않는다. Kozak 시퀀스를 추가하지 마십시오. pEU-E01-MCS 벡터에는 E01 번역 증강제가 있습니다.</li>
		<li>1/25 부피의 DpnI 제한 효소를 PCR 산물에 추가하여 주형 플라스미드 DNA를 제거합니다. 37°C에서 30분 동안 배양합니다.</li>
		<li>PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제하고 농도를 20–50 ng/μL로 조정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>pEU-E01-MCS 벡터를 선형화합니다.<ol><li>pEU-E01-MCS, 프라이머 3 및 프라이머 4를 사용하여 역 PCR을 수행합니다.</li>
		<li>1/25 부피의 DpnI 제한 효소를 역 PCR 산물에 추가합니다. 37°C에서 30분 동안 배양합니다.</li>
		<li>PCR 정제 키트를 사용하여 제조업체의 권장 사항에 따라 PCR 제품을 정제합니다. 농도를 20–50 ng/μL로 조정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>2μL의 삽입 DNA 단편, 2μL의 선형화된 벡터 및 4μL의 2x 이음매 없는 클로닝 효소 혼합물을 혼합합니다.</li>
	<li>원활한 클로닝 제품으로 대장균 균주 JM109를 변형시킵니다. 스프레더를 사용하여 LB- 암피실린 한천 플레이트에 박테리아 현탁액을 펼칩니다. 참고: pEU 벡터에는 암피실린 내성 마커가 있습니다.</li>
	<li>pEU 플라스미드에서 MCS의 5' 및 3' 측으로부터 프라이머 5 및 프라이머 6을 사용하여 구축된 발현 플라스미드의 서열을 각각 확인하였다.</li>
	<li>발현 플라스미드를 증폭하고 정제한다.<ol><li>플라스미드-형질전환 된 대장균 균주 JM109를 LB-암피실린 배지 150mL에서 37°C에서 밤새 분당 125회 진탕하여 배양하였다.</li>
		<li>시판되는 플라스미드 프렙미디 키트를 사용하여 플라스미드를 추출하고 정제한다. 플라스미드를 500μL의 TE 완충액에 용해시킨다. 주의: 플라스미드 추출을 위해 미니 준비 키트를 사용하지 마십시오. 그것은 플라스미드의 충분한 품질과 양을 제공하지 않습니다.</li>
		<li>500μL의 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올을 추가합니다(25:24:1). 5분 동안 격렬하게 혼합하고 17,800 x g 및 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. 상부 플라스미드 용액을 새 튜브로 옮깁니다. 주의 : 페놀과 클로로포름으로부터 피부를 보호하기 위해 일회용 장갑을 착용하십시오. 참고: 플라스미드 추출 키트에서 RNase의 오염을 제거하려면 페놀-클로로포름 정제를 사용하여 플라스미드를 정제하십시오.</li>
		<li>클로로포름 500μL를 첨가하여 페놀을 완전히 제거합니다. 5분 동안 격렬하게 혼합하고 17,800 x g 및 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. 상부 플라스미드 용액을 새 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>2.5 부피의 에탄올과 1/8 부피의 7.5 M 암모늄 아세테이트를 추가하고 -30 °C에서 1 시간 동안 보관하십시오.</li>
		<li>4°C에서 17,800 x g 로 10분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 500 μL의 70 % 에탄올로 세척하십시오. 상청액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 5분 동안 그대로 두어 건조시킵니다.</li>
		<li>발현 플라스미드를 100μL의 초순수에 완전히 용해시킨다. 260 nm에서 흡광도로 플라스미드의 농도를 측정한다. 농도를 1 mg / mL로 조정하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 시험관 내 전사
주의: 전사 및 번역 단계에서 DNase 및 뉴클레아제가 없는 플라스틱 튜브와 팁을 사용하십시오. 오염을 방지하기 위해 플라스틱 제품을 고압 멸균하지 마십시오.
<ol><li>새 플라스틱 튜브에서 초순수를 수확하십시오. 주의 : 잔류 DEPC는 반응을 강력하게 억제하므로 DEPC 처리 된 물을 사용하지 마십시오. 전사 및 번역을 위해 신선하게 정제된 초순수를 사용하십시오.</li>
	<li>115.2μL의 초순수, 40μL의 전사 버퍼 LM, 20μL의 NTP 혼합물, 2.4μL의 80U/μL RNase 억제제, 2.4μL의 80U/μL SP6 중합효소 및 20μL의 1mg/mL pEU 발현 플라스미드를 혼합하여 전사 반응 혼합물을 준비합니다. 시약을 뒤집어 부드럽게 혼합하십시오. 빠른 회전을 수행하십시오.</li>
	<li>전사 반응을 37°C에서 6시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>반전하여 반응을 부드럽게 혼합하고 빠르게 회전시킵니다. 번역을 위해 즉시 사용하고, 그렇지 않으면 -80 °C에서 동결 및 보관하십시오.</li>
	<li>전기 영동으로 전사 생성물을 확인하십시오.<ol><li>1x TAE 완충액 100mL와 아가로스 1g을 혼합합니다. 이 현탁액을 전자레인지에서 가열하여 1% 아가로스 TAE 겔을 제조하였다.</li>
		<li>1μL의 전사 반응을 취하여 3μL의 물과 4μL의 2x 로딩 염료와 혼합합니다. 참고: RNA의 변성은 필요하지 않습니다.</li>
		<li>4 μL의 혼합물 및 2 μL의 DNA 래더 마커를 아가로스 TAE 겔에 로딩한다.</li>
		<li>100V에서 20 분 동안 전기 영동.</li>
		<li>에티듐 브로마이드에 젤을 30분 동안 염색합니다. UV 투과 조명기와 젤 이미저를 사용하여 mRNA의 사다리 밴드 패턴을 확인합니다. 참고: 500bp 미만의 번진 밴드가 관찰되면 mRNA 분해가 의심됩니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 번역 자료 준비
<ol><li>번역 버퍼를 준비합니다.<ol><li>50mL 튜브에 새로 준비된 초순수 27mL와 S1, S2, S3 및 S4용 각 40x 원액 0.75mL를 혼합합니다. 참고: 1x 변환 버퍼의 최종 필요한 양에 따라 재료의 양을 조절합니다. 주의 : 사용 후 여분의 1x 변환 버퍼를 보관하거나 다시 얼리지 마십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>크레아틴 키나아제 원액을 준비하십시오. 동결건조된 크레아틴 키나아제를 초순수에 최종 농도 20mg/mL까지 용해시킵니다. 0.2mL 8-스트립 PCR 튜브에 소량(각각 10 - 50μL)의 용액을 분주합니다. 튜브를 액체 질소로 동결시키고 -80 °C에서 보관하십시오. 주의 : 해동 후 크레아틴 키나아제 용액을 다시 얼리지 마십시오.</li>
	<li>투석 컵(0.1mL 크기)을 세척하여 투석막에서 글리세롤을 제거합니다. 참고: 여러 가지 크기의 투석 컵이 있습니다. 소형 컵(0.1mL)은 소규모 테스트(섹션 5.4)에 사용되고 대형 컵(2mL)은 대규모 생산(섹션 5.5)에 각각 사용됩니다. 대형 컵의 투석막의 세척 단계는 피할 수 있습니다.<ol><li>1mL의 초순수를 새 1.5mL 튜브에 넣습니다. 작은 크기의 투석 컵(0.1mL)을 튜브에 삽입합니다. 컵에 초순수 0.5mL를 넣습니다.</li>
		<li>실온에서 30분 이상 배양합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 리포좀의 제조
참고: 여기에서는 리포좀 준비를 위한 두 가지 프로토콜을 설명합니다. 하나는 바로 사용할 수있는 동결 건조 된 리포좀 (섹션 4.1)을 사용하는 반면, 다른 하나는 얇은 지질 필름을 수화 (섹션 4.2)하여 리포좀을 생성합니다.
<ol><li>동결건조된 리포좀을 사용하여 리포좀을 제조한다. 참고: 프로테올리포좀을 생산하는 더 쉬운 방법은 시중에서 판매되는 아솔렉틴 리포좀을 사용하는 것입니다. 아솔렉틴은 콩에서 추출한 천연 지질의 일종입니다.<ol><li>동결건조된 아솔렉틴 리포좀 10mg이 들어 있는 바이알( 재료 표 참조)을 열고 200μL의 번역 완충액(섹션 3.1)을 바이알 바닥에 추가합니다. 바이알을 밀봉하고 10분 동안 배양합니다.</li>
		<li>바이알을 와류 믹서에 1 분 동안 올려 놓고 격렬하게 혼합합니다.</li>
		<li>바이알을 50mL 튜브에 삽입합니다. 500 x g 에서 1분 동안 원심분리하여 튜브를 회전시킵니다.</li>
		<li>피펫을 사용하여 아솔렉틴 리포좀 현탁액(50mg 지질/mL)을 새 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 번역을 위해 즉시 리포좀을 사용하고, 그렇지 않으면 액체 질소에서 동결하고 -80 °C에서 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>얇은 지질 필름에 수분을 공급하여 리포좀을 준비합니다.<ol><li>지질이 분말 형태로 판매되는 경우 클로로포름 또는 적절한 유기 용매에 10-100 mg / mL 농도로 녹입니다. 참고: 얇은 지질 필름은 정제 및/또는 합성된 양친매성 지질을 사용하여 제조할 수 있습니다. 아솔렉틴의 정제 방법은 앞서 설명하였다38. 기능적으로 변형된 지질, 예컨대 비오티닐화 지질, 형광 지질 및 보조 지질은 기능성 리포좀을 생성하기 위해 기저 지질에 첨가될 수 있다.</li>
		<li>50mg의 지질을 함유한 지질 용액을 증발 플라스크로 옮깁니다.</li>
		<li>회전 증발기를 사용하여 용매를 증발시키고 플라스크 바닥의 벽에 지질을 고르게 펴서 지질 박막을 형성합니다.</li>
		<li>플라스크를 진공 데시케이터에 넣고 밤새 음압 하에 두어 용매를 완전히 제거합니다.</li>
		<li>증발 플라스크에 1mL의 번역 버퍼를 추가합니다. 플라스크를 회전시켜 얇은 지질 필름 위에 완충액을 퍼뜨립니다. 필름에 수분을 공급하기 위해 5분 동안 배양합니다.</li>
		<li>초음파 균질화 기 또는 초음파 세척기로 플라스크를 초음파 처리하십시오. 용액이 필름에 완전히 닿을 수 있도록 때때로 플라스크의 각도를 변경하십시오. 얇은 지질 필름이 바닥에서 벗겨지고 완전하고 균질하게 유화되었는지 확인하십시오. 참고: 리포좀을 포함하는 비오틴화 지질의 전자 현미경 사진은 그림 1에 나와 있습니다.</li>
		<li>리포좀 현탁액(50mg 지질/mL)을 새 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 즉시 사용하지 않을 경우에는 리포좀을 액체 질소에 동결시키고 -80°C에서 보관한다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 시험관 내 번역
<ol><li>밀 배아 추출물을 실온에서 몇 분 동안 물에 떠서 빠르게 해동하십시오. 해동 후 즉시 튜브를 뒤집어 부드럽게 혼합하고 스핀 다운하고 사용할 때까지 얼음에서 식히십시오. 알림: 사용 후 밀 배아 추출물을 액체 질소에 동결하고 -80 ° C에서 보관하십시오. 여러 번의 동결/해동 주기를 견뎌냅니다.</li>
	<li>20 mg / mL 크레아틴 키나아제 원액을 해동. 5 μL의 원액과 45 μL의 번역 완충액을 혼합하여 2 mg / mL 크레아틴 키나아제 작업 용액을 준비합니다. 주의 : 크레아틴 키나아제 재 냉동은 권장하지 않습니다.</li>
	<li>필요한 경우 리포좀 또는 mRNA를 해동합니다.</li>
	<li>소규모 단백질 번역을 수행하십시오.<ol><li>단계 3.3.2에서 준비한 대로 튜브와 투석 컵(0.1mL) 모두에서 물을 제거합니다.</li>
		<li>튜브와 투석 컵에 각각 1mL 및 300μL의 번역 버퍼를 주입합니다. 주의: 투석 컵의 바닥이 1.5mL 튜브의 번역 버퍼 표면에 닿지 않는 경우 튜브에 50–100μL의 버퍼를 추가로 주입합니다.</li>
		<li>15.6μL의 번역 완충액, 2.4μL의 2mg/mL 크레아틴 키나제, 12μL의 50mg/mL 리포좀, 15μL의 밀 배아 추출물 및 15μL의 mRNA를 혼합하여 번역 반응 혼합물을 준비합니다. 튜브를 뒤집어 부드럽게 혼합하고 스핀 다운합니다.</li>
		<li>200 μL 피펫을 사용하여 번역 반응 혼합물 60 μL를 흡인한다.</li>
		<li>피펫 팁을 투석 컵의 번역 버퍼 아래쪽에 삽입합니다. 반응 혼합물을 천천히 부드럽게 피펫팅합니다. 증발을 방지하기 위해 투석 컵을 뚜껑으로 덮으십시오. 알림: 반응 혼합물은 컵 바닥으로 자연스럽게 가라앉고 이중층을 형성합니다. 컵을 혼합하거나 흔들어 이중층을 방해하지 마십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>대규모 번역을 수행합니다(그림 1).<ol><li>25mL 튜브에 번역 버퍼 22mL를 붓습니다. 대형 투석 컵(2mL)을 튜브에 넣고 컵에 번역 버퍼 2mL를 추가합니다.</li>
		<li>130 μL의 번역 완충액, 2 mg/mL 크레아틴 키나아제 20 μL, 50 mg/mL 리포좀 100 μL, 125 μL의 밀 배아 추출물 및 125 μL의 mRNA를 혼합하여 번역 반응 혼합물을 준비합니다. 피펫팅으로 부드럽게 섞습니다.</li>
		<li>모든 번역 반응 혼합물(500 μL)을 1,000 μL 피펫을 사용하여 흡인한다. 번역 반응 혼합물을 단계 5.4.5에 기재된 것과 동일한 방법으로 투석 컵에 주입한다. 증발을 방지하기 위해 투석 컵을 뚜껑으로 덮으십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>반응물을 15°C에서 24시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>피펫팅으로 투석 컵에서 반응을 잘 혼합합니다. 조잡한 프로테올리포좀 현탁액을 새 튜브로 옮깁니다. 참고: 바닥이 평평한 1.5mL 튜브를 사용하여 소규모 번역에서 프로테올리포좀을 수집하는 것이 좋습니다. 원심분리 후, 리포좀은 튜브의 바닥 모서리에 작고 쉽게 볼 수 있는 펠릿을 형성합니다.</li>
</ol>6. 프로테올리포좀의 정제
<ol><li>조 프로테올리포좀 현탁액이 들어 있는 튜브를 4°C에서 17,800 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상청액을 제거하십시오. 프로테올리포좀 펠렛을 피펫팅에 의해 PBS(소규모: 1mL, 대규모: 10mL)에 현탁시킨다.</li>
	<li>다른 두 개의 원에 대해 프로테올리포좀의 원심분리 및 세척을 반복합니다.</li>
	<li>세척 후 소량의 PBS를 넣고 피펫팅으로 프로테올리포좀 펠릿을 잘 재현탁합니다. 마이크로 피펫을 사용하여 현탁액의 부피를 측정합니다. PBS를 추가하여 부피를 60μL(소규모) 또는 500μL(대규모)로 조정합니다. 현탁액을 새 1.5mL 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>10μL의 프로테오리포좀 현탁액을 SDS-PAGE용 새 PCR 튜브로 옮깁니다. 필요할 때 사용할 수 있도록 나머지 샘플을 더 작은 부분으로 나눕니다. 액체 질소에서 동결하고 -80 °C에서 보관하십시오.</li>
</ol>7. SDS-PAGE 및 CBB 염색
<ol><li>70μL의 물과 40μL의 3x SDS-PAGE 샘플 버퍼를 10μL의 프로테올리포좀 현탁액에 추가합니다. 주의 : 막 단백질이 응집되므로 SDS-PAGE 샘플을 끓이지 말고 전기 영동에서 아크릴 아미드 겔에 거의 침투하지 마십시오. 또한 산화를 방지하기 위해 SDS-PAGE 샘플 버퍼(예: 3% 최종 농도의 2-메르캅토에탄올)에 충분한 환원제를 첨가합니다.</li>
	<li>전기영동 챔버에서 5%-20% 그래디언트 SDS-PAGE 겔을 설정합니다. 3 μL, 6 μL, 12 μL의 프로테올리포좀 샘플, 2 μL의 단백질 크기 마커 및 BSA 표준 시리즈도 로드합니다.</li>
	<li>52 mA, 400 V에서 30 분 동안 전기 영동.</li>
	<li>CBB 염료로 젤을 1 시간 동안 염색하십시오. 뜨거운 물에서 탈색하고 젤 이미지를 스캔합니다.</li>
	<li>NIH Image J 소프트웨어(https://imagej.nih.gov/ij/)를 사용하여 각 레인에서 막 단백질의 밴드 강도를 정량화합니다. BSA 표준 시리즈로 합성된 막 단백질의 양을 추정합니다.</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

제시된 프로토콜은 높은 성공률로 막 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 이 프로토콜은 간단하고 재현성이 높으며 확장하기 쉽습니다. 또한 많은 양의 막 단백질을 소비하는 실험의 시간과 비용을 줄일 수 있는 잠재력이 있습니다. 이중층 투석 방법은 이중층 방법 또는 투석 방법에 비해 생산성을 4-10배 향상시킵니다(그림 2B)45. 극단적 인 경우, 이온 채?...

막 단백질은 진단 및 치료에서 가장 중요한 약물 표적 중 하나입니다. 실제로, 작은 복합 약물 표적의 절반은 막 단백질, 예를 들어 G- 단백질 결합 수용체 (GPCR) 및 이온 채널1입니다. 수년에 걸쳐 연구자들은 막 단백질의구조와 기능을 밝히기 위해 생화학적, 생물물리학적, 구조적 연구를 수행해 왔습니다2,3. 막 단백질에 대한 단일 클론 항체의 개발은 기능적 및 구조적 연구를 가속화하고 치료 및 진단 응용 프로그램 4,5,6,7,8,9를 개발하기 위해 적극적으로 수행됩니다. 이러한 모든 연구는 다량의 고품질 막 단백질을 필요로합니다10. 예를 들어, 항체 발달을 위해서는 자연적인 형태를 가진 수 밀리그램의 정제 된 막 단백질이 필요합니다. X선 결정학에는 훨씬 더 많은 양의 고도로 정제된 막 단백질이 필요합니다. 그러나 막 단백질의 대량 생산은 막 단백질 연구11에서 병목 현상으로 남아 있습니다. 막 단백질은 하나 이상의 막 횡단 나선과 복잡한 구조를 가지며 세포 항상성에서 중요한 역할을합니다. 막 단백질의 이종 과발현은 높은 국소 농도로 축적되는 막 단백질의 응집 또는 세포 신호 경로의 교란과 같은 여러 장애물을 유발합니다. 발현이 성공적이더라도 샘플 준비의 후속 단계도 어려움에 직면합니다. 예를 들어, 프로테올리포좀의 제조에는 막 단백질의 가용화, 정제 및 안정화에 대한 높은 수준의 기술과 전문적인 경험이 필요하며 많은 노력과 시간이 소요됩니다12,13.
다른 한편으로, 최근 수십 년 동안 살아있는 세포14,15,16,17,18을 사용하지 않고 단백질을 생산하기 위해 일부 첨단 기술이 등장했습니다. 무세포 단백질 합성 기술은 시험관에서 번역 반응을 재구성합니다. 세포 발현 시스템이 갖는 제한이 없기 때문에, 무세포 시스템은 발현하기 어렵거나 세포에서 독성을 나타내기 어려운 다양한 단백질을 합성할 가능성이 있다. 정제된 세포 추출물 또는 재구성된 번역 기계는 주형 mRNA, 아미노산 및 에너지원과 혼합되고 재조합 단백질은 짧은 시간 내에 합성됩니다. 막 단백질 합성과 관련하여, 리포좀, 비셀, 나노디스크, 또는 공중합체와 같은 지질 또는 양친매성으로 구성된 일부 종류의 스캐폴드가 무세포 반응에 첨가된다 19,20,21,22,23,24. 합성된 막 단백질은 스캐폴드와 상호작용하고 물에서 안정화될 수 있다. 무세포 합성 막 단백질은 기능 연구 및 항체 생산 25,26,27,28,29,30,31에 널리 사용된다.
이 프로토콜에서, 우리는 밀 무세포 시스템 및 리포좀을 사용하는 프로테올리포좀 생산의 효율적인 무세포 방법을 설명한다. 밀 무세포 단백질 합성 시스템은 밀 배아15,32,33에서 추출한 추출물을 사용하는 강력한 시험관 내 번역 시스템입니다. 밀 배아는 많은 양의 번역 기계와 번역 억제제를 거의 포함하지 않습니다. 진핵생물의 구성원인 밀의 번역 기계는 진핵 단백질을 번역하는 데 적합하며, 그 번역 효율은 주형 mRNA의 코돈 사용에 거의 영향을 받지 않습니다. 밀 무 세포 시스템을 사용하여 단백질 키나아제 34,35, 유비퀴틴 리가 아제36, 전사 인자37 및 성공률이 높은 막 단백질을 포함한 다양한 단백질을 합성했습니다. 막 단백질 생산을 위해, 우리는 스캐폴드19,38로서 번역 혼합물에 지질 소포 리포좀을 첨가한다. 막 단백질의 소수성 도메인은 지질 이중층과 상호 작용하며 리포솜과 자발적으로 통합됩니다. 밀도 구배 원심분리는 번역 반응 혼합물의 일반적인 원심분리가 프로테올리포솜(20)의 단순 정제에 충분함에도 불구하고 내인성 밀 단백질로부터 프로테올리포좀을 엄격하게 분리하는 데 사용됩니다. 많은 종류의 일체형 막 단백질이 밀 무 세포 시스템을 사용하여 합성되었으며 다양한 연구 및 개발 25,38,39,40,41,42,43,44에 적용되었습니다. 또한, 우리는 대규모 생산45,46을위한 "이중층 투석 방법"을 개발했습니다. 이 방법에서는 컵형 투석 장치를 기질 공급 완충액에 침지하고, 그림 1과 같이 컵에 2층의 번역 반응 혼합물과 기질 공급 완충액을 형성한다. 기질의 지속적인 공급 및 부산물 제거는 반응 혼합물의 상단과 하단 모두에서 장시간 효율적으로 수행될 수 있어 우수한 번역 효능을 제공합니다(그림 2A 및 그림 2B)45.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#215;3 SDS-PAGE sample buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Containing 10% 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-20% gradient SDS-PAGE gel</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>E-D520L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Diluted ethanol by ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>02406-95</td>
			<td>As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>02739-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asolectin Liposome, lyophilized</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-PLE-ASL</td>
			<td>A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA standard</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 &#181;L &#215;1 SDS-PAGE sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB gel stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clone of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>08402-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Temperature ranging from 0 to 40 &#176;C or wider.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>04524977190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cup (0.1 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cup (2 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88404</td>
			<td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder marker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0311</td>
			<td>GeneRuler 1 kb DNA Ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD1703</td>
			<td>FastDigest DpnI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain JM109</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis chamber</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.5%)</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>14713-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evaporation flask, 100 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel scanner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use document scanner and LED immuninator as a substitute.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipids of interest</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge</td>
			<td>TOMY</td>
			<td>MX-307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP mix</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-NTP</td>
			<td>Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free 25 mL tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>362-025-MYP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucrease-free plastic tubes</td>
			<td>Watson bio labs</td>
			<td></td>
			<td>Do not autoclave. Use them separately from other experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucrease-free tips</td>
			<td>Watson bio labs</td>
			<td></td>
			<td>Do not autoclave. Use them separately from other experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740609</td>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEU-E01-MCS vector</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>311-90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid prep Midi kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740410</td>
			<td>NucleoBond Xtra Midi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3&#8217; 
			Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn&#8230;. (20-30 bp) shows gene specific sequence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3&#8217; 
			Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn&#8230;. (20-30 bp) shows gene specific sequence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3&#39; 
			Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3&#39; 
			Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3&#8217; 
			Sequencing primer, forward</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3&#8217; 
			Sequencing primer, reverse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein size marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610394</td>
			<td>Precision Plus Protein Standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seamless cloning enzyme mixture</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2611L</td>
			<td>Gibson Assembly Master Mix 
			Other seamless cloning reagents are also avairable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase &#38; RNase Inhibitor</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-ENZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submarine Electrophoresis system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Buffer LM</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-5TB-LM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation buffer</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-SUB-SGC</td>
			<td>SUB-AMIX SGC (&#215;40) stock solution (S1, S2, S3, S4). 
			Prepare &#215;1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave. 
			We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system. 
			Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer</td>
			<td>Branson</td>
			<td>SONIFIER model 450D-Advanced</td>
			<td>Ultrasonic cleaner can be used as a substitute.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV transilluminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ extract</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-WGE-7240</td>
			<td>WEPRO7240</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free production of proteoliposomes for functional analysis and antibody development targeting membrane proteins

막 단백질은 다양한 세포 과정에서 필수적인 역할을 하며 중요한 기능을 수행합니다. 막 단백질은 모든 약물의 절반 이상을 표적으로 삼기 때문에 약물 발견에서 의학적으로 중요합니다. 막 단백질의 생화학적, 생물물리학적, 구조적 연구와 항체 개발의 걸림돌은 정확한 형태와 활성을 가진 고품질 막 단백질을 대량으로 생산하는 데 어려움이 있다는 것입니다. 여기에서는 밀 배아 무세포 시스템, 리포좀 및 투석 컵을 사용하여 막 단백질을 효율적으로 합성하고 높은 성공률로 단시간에 정제된 프로테올리포좀을 제조하는 "이중층 투석 방법"에 대해 설명합니다. 막 단백질은 GPCR, 이온 채널, 수송체 및 테트라스파닌과 같은 수 밀리그램만큼 생산될 수 있습니다. 이 무세포 분석법은 고품질 프로테올리포좀을 제조하는 데 드는 시간, 비용 및 노력을 줄이는 데 기여하며 막 단백질의 기능 분석, 약물 표적 스크리닝 및 항체 개발에 적합한 수단을 제공합니다.

이 프로토콜을 사용하면 부분적으로 정제 된 프로테올리포좀을 짧은 시간 내에 얻을 수 있습니다. 대표적인 결과를 도 2A에 나타내었다. 클래스 A, B 및 C의 25 개의 GPCR을 이중층 투석 방법 (소규모)을 사용하여 성공적으로 합성하고 원심 분리 및 완충액 세척에 의해 부분적으로 정제했습니다. 합성된 단백질의 양은 단백질의 종류에 따라 다르지만, 일반적으로 대형 투석 컵을 ...

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Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

이 프로토콜은 밀 무세포 시스템 및 리포좀을 사용하는 이중층 투석 방법에 의한 고품질 프로테올리포좀의 생산을 위한 효율적인 무세포 방법을 설명합니다. 이 방법은 막 단백질의 기능 분석, 약물 표적 스크리닝 및 항체 개발에 적합한 수단을 제공합니다.

막 단백질을 표적으로 하는 기능 분석 및 항체 개발을 위한 프로테올리포좀의 무세포 생산

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.6K 조회수.  Ehime University. 이 프로토콜은 밀 무세포 시스템 및 리포좀을 사용하는 이중층 투석 방법에 의한 고품질 프로테올리포좀의 생산을 위한 효율적인 무세포 방법을 설명합니다. 이 방법은 막 단백질의 기능 분석, 약물 표적 스크리닝 및 항체 개발에 적합한 수단을 제공합니다.

비디오: Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in the cytoplasm. Commonly used methods for the display and screening of recombinant antibody libraries do not incorporate intracellular protein folding quality control, and, thus, the antigen-binding capability and cytoplasmic folding and solubility of antibodies engineered using these methods often must be engineered separately. Here, we describe a protocol to screen a recombinant library of single-chain variable fragment (scFv) antibodies for antigen-binding and proper cytoplasmic folding simultaneously. The method harnesses the intrinsic intracellular folding quality control mechanism of the Escherichia coli twin-arginine translocation (Tat) pathway to display an scFv library on the E. coli inner membrane. The Tat pathway ensures that only soluble, well-folded proteins are transported out of the cytoplasm and displayed on the inner membrane, thereby eliminating poorly folded scFvs prior to interrogation for antigen-binding. Following removal of the outer membrane, the scFvs displayed on the inner membrane are panned against a target antigen immobilized on magnetic beads to isolate scFvs that bind to the target antigen. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based secondary screen is used to identify the most promising scFvs for additional characterization. Antigen-binding and cytoplasmic solubility can be improved with subsequent rounds of mutagenesis and screening to engineer antibodies with high affinity and high cytoplasmic solubility for intracellular applications.

We provide a method to simultaneously screen a library of antibody fragments for binding affinity and cytoplasmic solubility by using the Escherichia coli twin-arginine translocation pathway, which has an inherent quality control mechanism for intracellular protein folding, to display the antibody fragments on the inner membrane.

항체 단편의 라이브러리를 스크리닝에 대한 세균 내부 멤브레인 디스플레이

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

연구

생화학

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

This protocol describes the production of a therapeutic antibody in a mammalian expression system. The methods described include preparation of vector DNA, stable transfection and serum-free adaptation of a human embryonic kidney 293 cell line, set up of large scale cultures and purification using affinity chromatography.

실험실 규모의 생산과 치료 용 항체의 정제

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The mass production and distribution of antibodies specific to histone PTMs has greatly facilitated research on these marks. As histone PTM antibodies are key reagents for many chromatin biochemistry applications, rigorous analysis of antibody specificity is necessary for accurate data interpretation and continued progress in the field. This protocol describes an integrated pipeline for the design, fabrication and use of peptide microarrays for profiling the specificity of histone antibodies. The design and analysis aspects of this procedure are facilitated by ArrayNinja, an open-source and interactive software package we recently developed to streamline the customization of microarray print formats. This pipeline has been used to screen a large number of commercially available and widely used histone PTM antibodies, and data generated from these experiments are freely available through an online and expanding Histone Antibody Specificity Database. Beyond histones, the general methodology described herein can be applied broadly to the analysis of PTM-specific antibodies.

This manuscript describes methods for applying peptide microarray technology to specificity profiling of antibodies that recognize histones and their post-translational modifications.

펩티드 Microarrays를 가진 Histone 항체 특이성의 분석

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers are less compatible with detergents.
Here we describe a strategy for bypassing this fundamental limitation using fusogenic oppositely charged liposomes bearing a membrane protein of interest. Fusion between such vesicles occurs within 5 min in a low ionic strength buffer. Positively charged fusogenic liposomes can be used as simple shuttle vectors for detergent-free delivery of membrane proteins into biomimetic target lipid bilayers, which are negatively charged. We also show how to reconstitute membrane proteins into fusogenic proteoliposomes with a fast 30-min protocol.
Combining these two approaches, we demonstrate a fast assembly of an electron transport chain consisting of two membrane proteins from E. coli, a primary proton pump bo3-oxidase and F1Fo ATP synthase, in membranes of vesicles of various sizes, ranging from 0.1 to &#62;10 microns, as well as ATP production by this chain.

Here we present two ultrafast protocols for reconstitution of membrane proteins into fusogenic proteoliposomes, and fusion of such proteoliposomes with target lipid bilayers for detergent-free delivery of these membrane proteins into the postfusion bilayer. The combination of these approaches enables fast and easily controlled assembly of complex multi-component membrane systems.

세제 없는 보완 청구 Proteoliposomes Fusogenic를 사용 하 여 지질 Bilayers에 막 단백질의 초고속 재구성.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used strategy for RBP capture exploits the polyadenylation [poly(A)] of target RNAs, which mostly occurs on eukaryotic mature mRNAs, leaving most binding proteins of non-poly(A) RNAs unidentified. Here we describe the detailed procedures of a recently reported method termed click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC), which enables the transcriptome-wide capture of both poly(A) and non-poly(A) RBPs by combining the metabolic labeling of RNAs, in vivo UV cross-linking, and bioorthogonal tagging.

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

A detailed protocol for applying the click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategy to identify proteins binding to both coding and noncoding RNAs is presented.

캡처 클릭 화학 기반 RNA 위하여를 사용 하 여 RNA 의무적인 단백질의 포착 (CARIC) 전략

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The classic silver stains have certain drawbacks, such as high background staining, poor protein recovery, low reproducibility, a narrow linear dynamic range for quantification, and limited compatibility with mass spectrometry (MS). Now, with the use of a fluorogenic Ag+ probe, TPE-4TA, we developed a fluorescent silver staining method for the total protein visualization in polyacrylamide gels. This new stain avoids the troublesome silver reduction step in traditional silver stains. Moreover, the fluorescent silver stain demonstrates good reproducibility, sensitivity, and linear quantification in protein detection, making it a useful and practical protein gel stain.

Here, we describe a detailed protocol outlining a new fluorescent staining technique for total protein detection in polyacrylamide gels. The protocol utilizes a silver ion-specific fluorescence turn-on probe, which detects Ag+-protein complexes, and eliminates certain limitations of traditional chromogenic silver stains.

Polyacrylamide 젤에 단백질의 형광은 얼룩

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences in a structurally similar protein, in order to determine the functional importance of these regions. Such chimeras are generated by means of a nested PCR protocol using overlapping DNA fragments and adequately designed primers, followed by their expression within a mammalian system to ensure native secondary structure and post-translational modifications. 
The functional role of a distinct region is then indicated by a loss of activity of the chimera in an appropriate readout assay. In consequence, regions harboring a set of critical amino acids are identified, which can be further screened by complementary techniques (e.g. site-directed mutagenesis) to increase molecular resolution. Although limited to cases in which a structurally related protein with differing functions can be found, chimeric proteins have been successfully employed to identify critical binding regions in proteins such as cytokines and cytokine receptors. This method is particularly suitable in cases in which the protein's functional regions are not well defined, and constitutes a valuable first step in directed evolution approaches to narrow down the regions of interest and reduce the screening effort involved.

Structurally related proteins frequently exert distinct biological functions. The exchange of equivalent regions of these proteins in order to create chimeric proteins constitutes an innovative approach to identify critical protein regions that are responsible for their functional divergence.

공상 단백질 구축을 통한 기능성 단백질 영역 식별

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

대장균의 이종 식에 의한 멤브레인 수송기의 특성화 및 멤브레인 소포 생산

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...