이 방법은 백혈구가 어떻게 활성화되고 개별 알러지 유발 물질에 대한 알레르기가 어떻게 발생하는가와 같은 면역학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 견고하고 재현 가능한 알레르기 마우스 모델의 주요 장점은 실험 인구와 더 낮은 차이를 산출하기 위해 적은 마우스를 사용할 수 있다는 것입니다. 면역 반응을 제어하는 새로운 면역 요법은 생체 내 효능을 테스트하는 초기 수단으로 견고한 마우스 모델을 필요로 합니다.
따라서, 이 기술의 의미는 알레르기 면역 요법으로 확장됩니다. 이 방법은 알레르기에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만 원치 않는 항체 반응이 질병에 중요한 역할을하는 자가 면역과 같은 다른 시스템에도 적용 될 수 있습니다. 일반적으로, 이 방법에 새로운 개인 때문에 리포소말 나노 입자와 함께 작업하는 경험의 부족 또는 마우스 작업에 필요한 기술에 경험이 부족하기 때문에 투쟁 할 것이다.
단백질에 이트로비기능 크로스링커의 2.5 어금니를 추가하고 약 1시간 동안 실온에서 진동 셰이커에 반응을 배치하여 시작합니다. SPDP와 1 시간 배양 후, 100 밀리머 나트륨 아세테이트로 평형 컬럼에 단백질을 탈염하고 분수를 수집합니다. 280나노미터 흡광도를 결정하고 상단 분획을 풀수 있습니다.
PBS에서 컬럼을 세척하고 25밀리머 디티오스레이톨 또는 DTT를 풀로 된 단백질 분획에 넣고 5-10분 배양에 넣습니다. 이어서, 단백질과 링커의 어모함에 기초하여 연결 비율을 계산할 수 있도록 단백질의 280 및 343 나노미터 흡광도를 측정한다. 다음으로, PBS 세척 컬럼의 풀링된 분획을 실행하고, 입증된 대로 280나노미터 및 상단 분획 풀링을 측정하기 위한 분획을 수집한다.
100x DSPE-PEG2000-Maleimide의 적절한 부피를 단백질에 추가하여 부드러운 소용돌이로 1x, 10배 의 어금다한 최종 농도를 달성합니다. 그런 다음 밀폐된 둥근 바닥 플라스크에서 질소 아래에서 밤새 반응을 실행합니다. 다음 날, 크로스 링크 드엑스트라안 젤 비드 컬럼 위에 단백질을 실행하고, 그들의 사용까지 섭씨 4도에서 지질 연결 단백질의 최종 풀드 분수를 저장합니다.
각 지질의 정확한 양이 계산되면 모든 지질을 12 밀리리터 보로실리케이트 유리 테스트 튜브에 결합하고 3 밀리리터 주사기와 튜브를 사용하여 질소로 클로로포름을 조심스럽게 날려 버리십시오. 그런 다음, 하룻밤 사이에 DMSO의 100 마이크로 리터로 용액을 lyophilize. 다음 날 아침, 12 밀리리터 지질 튜브에 지질 관련 단백질 1밀리리터를 추가하고 초음파 처리 수조에서 초음파 처리당 30~60초 동안 3~4회 초음파 처리하여 초음파 처리 사이에 최소 5분 간 휴식을 취합니다.
마지막 초음파 처리 후, 압출기에 배치 압출 주사기 중 하나에 샘플을로드하고 압출기의 다른 쪽 끝에 압출기 주사기를 배치합니다. 지질이 폴리카보네이트 0.8 마이크로미터 멤브레인을 통해 압출될 때 빈 주사기가 채워집니다. 완전히 조립된 압출기를 가열 블록에 넣고 플런저를 부드럽게 누르고 주사기를 비웁릅니다.
마지막 압출 후, 깨끗한 유리병으로 리포솜을 전송하고, 단지 입증된 것처럼 폴리카보네이트 0.2 및 0.1 마이크로미터 막을 통해 지질을 돌출한다. 그런 다음 리포솜을 섭씨 4도에 보관하십시오. 항원 리포솜 활성화에 대한 B 세포 반응을 모니터링하려면 칼슘 플럭스 로딩 버퍼에서 7번째 비장세포에 1.5배 10회 반복하고, 세포에 1.5마이크로몰러 Indo-1을 추가하여 튜브내용액을 여러 번 혼합한다.
37°C에서 30분간 수조 배양 후, 빛으로부터 보호되고, 칼슘 플럭스 적재 버퍼의 5배를 추가하고, Indo-1 라벨이 부착된 세포를 원심분리합니다. B 세포 게이팅의 경우, 안티 CD5 및 항 B220 항체를 가진 얼룩 세포는 20 분 동안 섭씨 4도에서 완충제의 0.5 밀리리터로 빛으로부터 보호됩니다. 인큐베이션이 끝나면 신선한 칼슘 플럭스 로딩 버퍼로 세포를 세척하고, 신선한 칼슘 플럭스가 얼음에 저장하기 위한 완충제를 실행하는 밀리리터당 7세포로 1~2회 10회, 빛으로부터 분석까지 보호한다.
다음으로, 0.5 밀리리터의 세포를 뚜껑, 5밀리리터, 둥근 바닥, 폴리스티렌 튜브에 넣고 수조에서 섭씨 37도까지 세포를 데우십시오. 3~5분 후, 튜브를 재순환 수조에 연결된 37도 의 물자식 챔버로 옮기고 유동 세포계의 물자켓으로 튜브를 실행합니다. 초당 5, 000 ~ 10, 000 이벤트를 수집한 후 셀이 15~30초 동안 안정화되고 데이터 수집을 다시 시작하여 최소 10초 동안 데이터를 수집하여 백그라운드 판독을 수립할 수 있습니다.
10초 마크에서, 유동 세포계에서 튜브를 신속하게 제거하고 항원성 리포솜의 적절한 실험 농도를 추가한다. 그런 다음, 펄스 는 세포를 소용돌이, 추가 3 ~ 5 분 동안 사이토 미터에 튜브를 읽어. 동물을 민감하게 하기 위해, 4주에서 5주 된 BALB/c 암컷 마우스 수령인에게 경구 를 통해 콜레라 독소가 함유된 땅콩 추출물 200마이크로리터를 일주일에 한 번, 4주에는 희석된 땅콩 추출물 300마이크로리터를 전달한다.
28일, 땅콩 추출물을 PBS의 밀리리터당 1밀리그램의 최종 농도로 준비하고, 직장 온도계를 사용하여 각 민감화 동물의 기준체 온도를 측정합니다. 모든 온도를 측정하면, 각 수신자에게 땅콩 추출물 200 마이크로리터를 투여하여 회류 주사를 통해 투여하고, 주사 후 1시간 동안 15분마다 직장 온도계로 체온을 측정한다. 체온이 떨어지면 땅콩에 대한 알레르기가 있음을 나타냅니다.
땅콩 알레르기 성 마우스에서 비장 구장을 분리 한 후, 27 게이지, 5/8 인치 바늘을 장착 한 밀리리터 인슐린 주사기를 사용하여 추출 된 알레르기 비장 비장의 일곱 번째에 1.5 배 10 배, 순진한, 감각없는 동물의 꼬리 정맥에 1.5 배 를 주입하십시오. 입양 전달 후 하루, 정맥 내 200 개의 항원 성 리포좀을 각 BALB /c 마우스의 꼬리 정맥에 주입하여 알레르기 성 비백을 받았다. 리포솜 주사 후 2 주, i.p와 마우스를 밀어.
수용성 Ara h 2의 주사, 61일째에 200 마이크로리터 아라 h 2 챌린지가 이어졌습니다. 그런 다음, 입증된 대로 15분마다 직장 프로브로 체온을 측정합니다. 단백질 컨쥬게이션은 비결합 된 단백질에 비해 분자량의 증가를 나타내는 감소 젤을 실행하여 입증 될 수있다.
항원 성 리포솜 자극 B 세포 칼슘 플럭스를 평가하기 위해 살아있는 단일 세포를 게이트하여 B220 양성 CD5-음수 B 세포의 선택을 허용합니다. 시간이 지남에 따라 Indo-1 바이올렛 대 유도-1 의 비약은 리포솜 유도 B 세포 활성화의 양을 평가하기 위해 분석될 수 있다. ELISA에 의해 땅콩 추출물-감세화된 마우스의 혈청에서 아라 h 2 특이적 IgE 및 IgG1의 정량화는 아라 h 2로 증폭되는 부여된 감도를 가진 마우스가 혈청에서 측정 가능한 Ara h 2 특이적 IgE 및 IgG1을 나타낸다는 것을 나타냅니다.
Ara h 2 챌린지 중에 기록된 체온은 알레르기성 마우스가 어려움에 따라 체온이 감소하는 반면, 순진한 쥐의 체온은 일관성을 유지한다는 것을 알 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 너무 많은 단백질이 압출을 어렵게 만들 수 있기 때문에, 리포솜에 통합되는 지질 연결 단백질의 양을 주의 깊게 추적하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 알레르겐 특정 B 및 T 세포의 추적 및 분류와 같은 다른 방법은 이러한 알레르겐 특정 세포가 치료에 어떻게 반응하는지에 대한 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다.
이 기술은 알레르기 필드에 있는 연구원이 이 마우스 모형을 사용하여 알레르기성 질병을 싸우는 새로운 면역 요법을 탐구하는 쪽을 포장할 것입니다. 콜레라 독소로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 해당 사용에 대한 지침은 해당 지역의 제도적 생물학적 안전 기준에 따라 따라야 한다는 것을 잊지 마십시오.
