Name: establishing pollination requirements in japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping
Uploaded: 2020-11-09T15:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping at JoVE

이 연구는 Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y 알리멘타리아 (RFP2015-00015-00 및 RTA2017-00003-00);에 의해 투자되었습니다. 고비에르노 데 아라곤-유럽 사회 기금, 유럽 연합 (그루포 콘솔리다 A12-17R), 그리고 준타 드 엑스트레마두라 —폰도 유럽오 데 데사롤로 지역 (FEDER), 계획 지역 드 Investigación (IB16181), 그루포 드 Investigación (AGA001, GR1819). B.I. 게레로는 멕시코의 콘세조 나시오날 드 시엔시아 이 Tecnología (CONACYT, 471839)의 펠로우십에 의해 지원되었다.

1. 현장에서 수분 수분
<ol><li>
꽃가루 추출
	<ol>
<li>BBCH 스케일25,26의스테이지 57에 따르면 꽃가루를 얻으려면 스테이지 D24에서꽃봉오리를 수집하십시오. 참고: 다른 가지각선 종보다 일본 매화에서는 꽃봉오리가 더 적게 생산되기 때문에 꽃봉오리가 더 많이 필요합니다.</li>
		<li>플라스틱 메쉬(2mm x 2mm 모공 크기)를 사용하여 anther를 제거하고 실온에서 24시간 동안 종이에 놓아 주면 안소 침착이 가능합니다.</li>
		<li>꽃가루 곡물을 미세 한 메쉬 (0.26 mm x 0.26 mm 모공 크기)를 체질하고 사용할 때까지 4 °C의 캡이있는 10 mL 유리 튜브에 보존하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
꽃의 수분
	<ol>
<li>꽃의 10%~20%가 열려 있을 때 여러 가지를 선택하고 레이블을 지정합니다. BBCH 스케일25,26의스테이지 57에 따르면, 열린 꽃과 어린 싹을 제거하고 스테이지 D24에서꽃 봉오리만 남기고 있습니다.</li>
		<li>손톱이나 핀셋으로 치료당 800~1,000개의 꽃봉오리꽃잎, 세팔, 창자들을 제거합니다.</li>
		<li>손은 방출 후 24 h의 미세 한 페인트 브러시의 도움으로 피질을 수분합니다. 같은 품종의 꽃가루와 피슬의 절반을 포함하는 일부 가지, 대조군으로 다른 품종에서 호환 꽃가루와 다른 절반. 다른 품종의 꽃가루 곡물로 손가락 끝이나 페인트 브러시를 오염시키지 않도록주의하십시오.</li>
		<li>꽃의 주간 수를 기록하고 과일 드롭 패턴을 특성화하고 각 수분 처리에 설정 된 최종 과일을 정량화하기 위해 과일을 개발.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
현장에서 의 추가 수분
	<ol>
<li>첫 번째 꽃이 열리기 며칠 전에 0.8mm 메쉬 케이지에 선택된 나무를 둘러싸서 수분 곤충이 도착하는 것을 피하십시오.</li>
		<li>10%-20%의 꽃이 열리면 수분 처리당 여러 가지를 선택하고 라벨을 부착하여 치료당 1,000-1,500개의 꽃을 남깁니다.</li>
		<li>다음 날, 꽃이 열리면 해당 꽃가루 (자체 수분을위한 동일한 품종의 꽃가루및 교차 수분 제어와 같은 품종의 꽃가루)와 페인트 브러시의 도움으로 각 꽃을 수분하십시오.</li>
		<li>모든 꽃이 열릴 때까지 격일로 수분공급합니다.</li>
		<li>꽃의 주간 수를 기록하고 과일 드롭 패턴을 특성화하고 각 수분 처리에 설정 최종 과일을 정량화하기 위해 수확하기 위해 마취에서 과일을 개발.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 실험실에서 의 수중 오염
<ol><li>BBCH 스케일25,26의스테이지 57에 따르면 스테이지 D24에서50~100개의 꽃을 수집합니다.</li>
	<li>실험실에서 치료 당 30 개의 꽃을 방출합니다 (자기 및 교차 수분). 참고: 액슬에 손상을 방지하기 위해 신중하게 조광을 진행해야 합니다.</li>
	<li>젖은 꽃집 거품 (각 수분 처리에 대한 거품의 한 조각)의 조각에 배치하기 전에 각 꽃 페디셀 수중의 바닥에 신선한 컷을 합니다.</li>
	<li>손 은 이전에 수집 된 꽃가루와 미세 페인트 브러시를 사용하여 나중에 각 피스틸 24 시간 후 수분 (섹션 1.1 참조). 같은 품종의 꽃가루로 한 세트의 피스틸을 수분하고, 다른 세트는 호환되는 품종의 꽃가루를 대조합니다.</li>
	<li>실온에서 수분 후 72h의 수분된 피스틸을 둡니다. 꽃 거품은 지속적으로 물로 젖어야합니다.</li>
	<li>4°C에서 적어도 24시간 동안 에탄올/아세트산(3:1)의 고정 용액에서 피스틸을 수정합니다. 고정을 75%의 에탄올로 대체합니다. 샘플은27를사용할 때까지 4 °C에서이 용액에서 보존 될 수 있습니다. 참고: 샘플이 솔루션에 완전히 잠겨 있는지 확인합니다.</li>
</ol>3. 현미경 관찰
<ol><li>
체외 꽃가루 발아의 평가
	<ol>
<li>꽃가루 발아 매체를 정교하게 하려면 250mL의 증류수에 자당 25g을 녹인 다음 질산 칼슘 0.075 g [Ca(NO3)2]및 0.075 g의 붕산(H 3 BO3)을첨가하십시오.</li>
		<li>용액에 2 g의 한고를 넣고 완전히 용해 될 때까지혼합하십시오 28.</li>
		<li>매체를 살균하려면 120°C에서 20분 동안 자동 복제합니다. 매체를 냉각시키고 고화하기 전에 멸균 페트리 접시 당 3mL(55mm x 12mm)를 멸균 라미나르 플로우 후드에 분배합니다. 중간 정도의 고형화 후, 사용전까지 알루미늄 호일로 싸인 페트리 접시를 4°C로 보존하십시오.</li>
		<li>이전에 두 페트리 접시에 제어 된 꽃가루 기증자로 사용 각 품종의 꽃가루를 확산하고 24 시간 동안 25 ° C에서 배양. 참고: 접종된 배양 매체는 즉시 현미경 검사로 관찰하거나 사용전까지 -20°C에 저장될 수 있다. 이를 위해 페트리 요리는 현미경 관찰 전에 냉장고24h로 변경해야합니다.</li>
		<li>꽃가루 곡물을 관찰하려면 칼로오스얼룩이 1 % (v /v) 애니라인 블루 용액을 준비하십시오. 먼저, 0.1N칼륨 인산염 삼각염(K3PO4)용액을 1,000mL에서K3PO4의 7.97g을 용해하여 준비한다. 1% (v/v) 애니라인 블루 용액을 정교하게 하기 위해 0.1 N K3PO4의100mL에서 애니라인 블루 1mL를 녹입니다.</li>
		<li>각 페트리 접시에 2-3 방울의 애니라인 블루 용액을 추가하고 엑시터 필터 BP340-390 및 배리어 필터 LP425를 사용하여 UV 에피플루오렌스 현미경으로 5 분 후에 관찰하십시오. 플레이트 당 세 개의 필드에 실행 가능한 불가가 곡물을 계산, 각 필드는 포함 100-200 꽃가루 곡물, 각 품종에 대한 두 페트리 요리에.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
꽃가루 튜브 성장
	<ol>
<li>고정 된 피스틸을 증류수로 3 배 (각각 1 회, 총 3 시간)로 헹구고 24 시간 동안 4 ° C에서 5 % (w / v) 나트륨 황피염 (Na2SO3)으로이송합니다. 이 솔루션을 준비하려면 증류수 100mL에 설파이트 나트륨 5g을 녹입니다.</li>
		<li>조직을 부드럽게 하기 위해 5%(w/v) 나트륨에서 8분 동안 120°C에서 피스트를 오토클랩합니다.</li>
		<li>스쿼시 연화 된 피스틸은 1 % (v / v) 아일린 블루 용액을 슬라이드의 커버 유리 아래에 떨어뜨려 칼로스를 얼룩지게합니다.</li>
		<li>엑시터 필터 BP340-390 및 장벽 필터 LP425를 사용하여 UV 에피플루오렌스와 현미경으로 스타일을 따라 꽃가루 튜브 성장을 관찰한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 비호환성 관계 결정
<ol><li>잎에서 DNA 추출<ol>
<li>DNA를 추출하려면, 필드에 있는 각 품종의 3-4 개의 젊은 잎을 수집, 바람직하게는 봄에. 참고 : DNA는 성숙한 잎에서 추출 할 수 있지만 어린 잎의 DNA는 페놀 화합물이 적습니다.</li>
		<li>상용 키트를 사용하여 DNA를 분리하고 제공된 프로토콜 키트를 따릅니다(재료 표참조).</li>
		<li>UV-Vis 미세볼륨 분광계에서 DNA 농도를 정량화하고 260 nm에서 각 샘플의 DNA 품질을 평가합니다. DNA 농도를 10 ng/μL로 조정합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>단편 증폭을 위한 PCR 조건<ol>
<li>라벨 0.2 mL PCR 튜브 및 캡.</li>
		<li>표 1에 따라 PCR 시약을 준비하고 얼음 위에 해동시키십시오.</li>
		<li>반응당 16μL의 부피를 고려하여 반응 횟수와 초과 10%에 따라 각 프라이머 쌍의 마스터 믹스를 1.5mL 마이크로튜브에 설정합니다. 표 1에서 주문 후 시약을 추가하고 철저히 섞습니다.</li>
		<li>각 0.2 mL PCR 튜브에 마스터 믹스의 Aliquot 16 μL은 DNA 템플릿4 μL 또는 멸균 증류수 4 μL을 음의 대조군(C-)으로 함유한다. 알려진 유전자형을 가진 품종의 DNA를 긍정적 인 대조군으로 사용하십시오. 부드럽게 섞고, 반응 튜브를 캡으로 닫고, 원심분리기를 30s에 2,000 x g로 닫고 반응 튜브의 하단에 있는 전체 부피를 수집합니다.</li>
		<li>체온사이클러에 반응튜브를 배치하고 다음 온도 프로파일을 사용하여 PCR 프로그램을 설정: 94°C에서 3분, 94°C에서 1분의 35 사이클, 56°C에서 1분, 72°C에서 3분, 72°C에서 7분의 7분의 최종 단계를 설정한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>단편 크기의 전기 전동 및 추정<ol>
<li>1.7% (w/v) 아가로즈 미니 젤을 준비하려면 아가로즈 0.68 g와 1x TBE 버퍼 40mL을 100mL 에렌마이어 플라스크에 녹입니다. 끓는 것을 피하기 위해 전자레인지에서 600W 간격으로 가열하여 용액을 녹입니다.</li>
		<li>용액이 벤치에 머무르면 식힌 다음 핵산 염색 용액의 3.5 μL을 추가하십시오.</li>
		<li>젤 트레이를 주조 스탠드에 넣고 선택한 빗을 젤 몰드에 넣습니다. 각 PCR 제품 및 DNA 사다리에 대해 충분한 우물을 가져야 합니다.</li>
		<li>아가로즈 용액을 젤 몰드에 붓고 중합될 때까지 식힙니다. 중합체 젤의 빗을 제거합니다. 젤의 표면을 덮을 수 있는 충분한 1x TBE 버퍼를 포함하는 수평 전기 전광 시스템에 젤을 놓습니다.</li>
		<li>DNA 분자량 사다리(1kb DNA 사다리)의 2μL로 첫 번째 및 마지막 우물을 적재합니다. 다른 우물에 PCR의 각 제품의 3 μL을 로드합니다. 챔버를 닫고 전원을 켜고 젤을 100 V에서 30 분 동안 실행합니다.</li>
		<li>젤 문서화 시스템을 사용하여 UV 빛 아래에서 젤을 관찰하십시오. DNA 분자량 사다리를 사용하여 증폭된 단편의 크기를 결정하고 해당 알렐을 식별하기 위해 양성 대조군과 비교합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 꽃 날짜 모니터링
<ol><li>서로 다른 년 동안 꽃에 각 품종의 다른 나무의 phenology를 모니터링할 수 있습니다. 꽃의 길이를 첫 번째 (약 5%)에서 마지막 열린 꽃 (약 95 %)까지 설정합니다. BBCH 스케일25,26의스테이지 65에 따르면 꽃의 50 % 이상이 F24단계에있을 때 만개한 것으로 간주됩니다.</li>
	<li>호환 되는 품종의 꽃 날짜를 비교 하 고 매년 꽃 시간에 일치 하는 것을 결정 하려면, 몇 년에서 데이터와 꽃 시간의 달력을 정교 하 게.</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

본원에 설명된 방법론은 일본 매실 품종의 수분 요건을 위해 필드 또는 실험실에서 제어된 오염물질에 의한 각 품종의 자체(in) 호환성을 결정하고, 형광 현미경으로 꽃가루 튜브 성장의 후속 관찰을 요구한다. 비호환성 관계는 분자 지노티핑에 의한 S-alleles의 특성화에 의해 확립된다. 마지막으로, 수분 제의 선택은 매년 꽃에서 일치하는 그 품종을 검출하기 위해 모니터링 phenology에 의해 ?...

일본 매화(프룬스 살리시나 린들)는 중국1이원산지입니다. 19세기에 일본에서 미국으로 이 작물이 도입되어 다른 북미 디플로이드 자두2와교차했습니다. 20세기에, 이러한 하이브리드의 일부는 전 세계 온대 지역으로 확산되었다. 요즘에는 "일본 매실"이라는 용어는 원래 P. 살리시나 사이의 십자가에서 파생된 광범위한 상호 특이적 하이브리드를 말하며, 최대 15개의 다른 디플리드 Prunus spp.3,4,5.
일본 매화는 Rosaceae 가족의 다른 종과 마찬가지로 여러알렐을포함하는 단일 및 고다형성 S-메큐에 의해 제어되는 게임토피틱 자기 비호환성(GSI)을 전시합니다. S-메뚜기는 피스틸로 발현된 리보누클레스(S-RNase)와 꽃가루 곡물7에서발현된 F박스 단백질(SFB)을 인코딩하는 두 개의 유전자를 함유하고 있다. 자가비호환성 반응에서, 꽃가루 곡물(haploid)으로 발현된 S-allele이 피슬틸(diploid)에 발현된 두 가지 중 하나와 동일할 때, 스타일 전반에 걸친 꽃가루 관RNA의 성장은 S-RNase8의작용에 의해 꽃가루 관 RNA의 저하로 인해 체포된다. 이 과정은 배란에서 여성 게임 토피의 수정을 방지하기 때문에, GSI는 품종 사이의 횡단을 촉진.
일부 일본 매실 품종은 자기 호환이지만, 현재 재배 된 대부분의 품종은 자기 호환되지 않으며, 자신의 꽃을 수정하기 위해 호환 되는 기증자의 꽃가루가 필요합니다3. 아몬드9,살구10,11,12 및 달콤한 체리13과같은 프루누스 속의 돌 과일 종에서는 품종의 수분 요구 사항을 다른 접근법에 의해 확립 할 수 있습니다. 자가(in)호환성은 현장에서 꽃의 자가 수분및 과일 세트의 후속 모니터링에 의해 결정될 수 있으며, 또는 실험실에서 제어된 조건에서 반 생체 자체 질립및 현미경14,15,16,17,18의 꽃가루 튜브 관찰에 의해 결정될 수있다. . 품종 간의 비호환성 관계는 잠재적 인 수분화 품종의 꽃가루를 사용하여 필드 또는 실험실에서 교차 오염에 의해 결정될 수 있으며, PCR 분석에 의해 각 품종의 S-alleles의 식별에 의해 결정될 수있다14,15,16,20,21,22 . 달콤한 체리 나 아몬드와 같은 종에서, 자체 (in)호환성은 또한 아몬드23에서달콤한 체리13 또는 Sf에서 S4'로 자기 호환성에 관련된 특정 S 알레일의 식별에 의해 평가 될 수있다.
주요 생산국의 여러 매실 사육 프로그램은 알 수없는 수분 요구 사항을 가진 새로운 품종2,14의숫자를 발표하고 있습니다. 이 작품에서는 일본 매화형 하이브리드의 수분 요건 을 결정하는 방법론이 설명되어 있다. 자기(in)호환성은 분야와 실험실 모두에서 자체 오염에 의해 결정되며, 그 다음에형광 현미경 검사의 꽃가루 튜브를 관찰합니다. 수분화 품종의 선택은 현장에서 꽃 시간의 모니터링과 PCR 분석에 의한 S-유전자형의 식별을 결합합니다.

<table><tbody><tr><td>Acetic Acid Glacial</td><td>Panreac</td><td>131008.1611</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>iNtRON Biotechnology</td><td>25999</td><td></td></tr><tr><td>Aniline blue</td><td>Difco</td><td>8504-88</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid (H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Panreac</td><td>131015.1210</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Panreac</td><td>131231.1211</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>Deltalab</td><td>D102460</td><td>24 mm x 60 mm</td></tr><tr><td>Digital Camera</td><td>Imaging Developmet Systems</td><td>UI-1490SE</td><td></td></tr><tr><td>Digital Camera Software Suite</td><td>Imaging Developmet Systems</td><td>4.93.0.</td><td></td></tr><tr><td>DNA Oligos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix, 10 mM each</td><td>ThermoSischer Scientific</td><td>R0193</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green DNA polymerase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EP0713</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 96&amp;deg;</td><td>VWR-Chemicals</td><td>83804.360</td><td></td></tr><tr><td>1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb)</td><td>Invitrogen</td><td>15615-016</td><td>Size: 250&amp;micro;g; Conc: 1.0 &amp;micro;g/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>Gel Documentation System</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td></td></tr><tr><td>Hand Counter</td><td>Tamaco</td><td>TM-4</td><td></td></tr><tr><td>Image Lab Software</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Image Analyse System for Gel Documentation System</td></tr><tr><td>MetaPhor Agarose</td><td>Lonza</td><td>50180</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5415 R</td><td>Eppendorf</td><td>Z605212</td><td></td></tr><tr><td>Microscope with UV epiflurescence</td><td>Leica</td><td>DM2500</td><td>Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425</td></tr><tr><td>Microslides</td><td>Deltalab</td><td>D100004</td><td>26 mm x 76 mm</td></tr><tr><td>Mini Electrophoresis System</td><td>Fisherbrand</td><td>14955170</td><td></td></tr><tr><td>Minicentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15334204</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND1000</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes</td><td>Deltalab</td><td>200201</td><td>55 mm x 14 mm</td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Tribasic (K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;1.5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Panreac</td><td>141513</td><td></td></tr><tr><td>Primer forward &#039;Pru C2&#039;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer forward Pru T2&#039;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer reverse &#039;PCER&#039;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RedSafe Nucleic Acid Staining Solution</td><td>iNtRON Biotechnology</td><td>21141</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Panreac</td><td>131621.1211</td><td></td></tr><tr><td>Sodium sulphite anhydrous (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Panreac</td><td>131717.1211</td><td></td></tr><tr><td>Speedtools plant DNA extraction Kit</td><td>Biotools</td><td>21272</td><td></td></tr><tr><td>TBE Buffer (10X)</td><td>Panreac</td><td>A0972,5000PE</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler T100</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td>T1317</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Autoclave Presoclave II</td><td>JP Selecta</td><td>4001725</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisherbrand</td><td>11746744</td><td></td></tr></tbody></table>

establishing pollination requirements in japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping

일반적으로 재배되는 일본 매실 품종은 원래 프룬누스 살리시나와 다른 프룬스 종 사이의 십자가에서 파생된 상호 특이적 하이브리드입니다. 대부분의 하이브리드는 여러 개의 알렐을 포함하는 단일 및 고다형성 S-메큐에 의해 제어되는 게임토피틱 자체 비호환성을 나타낸다. 대부분의 재배 하이브리드는 자체 호환되지 않으며 꽃을 비옥하게하기 위해 호환 되는 기증자의 꽃가루가 필요합니다. 일본 매화의 수분 요건을 확립하는 것은 알려지지 않은 수분 요건을 가진 새로운 품종의 수가 많기 때문에 점점 더 중요해지고 있습니다. 이 작품에서는 일본 매화형 하이브리드의 수분 요건 을 결정하는 방법론이 설명되어 있다. 자가(in)호환성은 분야와 실험실 모두에서 수작업 오염에 의해 결정되며, 그 다음으로 형광 현미경으로 꽃가루 튜브 신장을 모니터링하고 현장에서 과일 성숙을 모니터링합니다. 수분화 품종의 선택은 PCR 분석에 의한 S-유전자형의 식별과 현장에서의 개화 시간 모니터링을 결합하여 평가된다. 품종의 수분 요구 사항을 알면 새로운 과수원 설계를 위한 품종 의 선택이 가능하고 확립된 과수원의 수분 결핍과 관련된 생산성 문제를 조기에 감지할 수 있습니다.

일본의 매화 꽃봉오리에는 1~3개의 꽃이 들어있는 꽃이 들어 있습니다. 다른 돌 과일 종에서와 마찬가지로, 각 꽃은 네 개의 소용돌이로 구성되어 있습니다 : 카펠, stamens, 꽃잎, 그리고 꽃의 기지에서 컵을 형성하는 융합되는 세팔. 꽃 구조는 다른 돌 과일보다 작으며, 소량의 꽃가루 곡물을 포함하는 stamens로 둘러싸인 짧고 깨지기 쉬운 피질이 있습니다. 만개시, 각 꽃의 꽃은 짧은 줄기에 분리 된 ?...

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Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping

일본 매화형 하이브리드의 수분 요건 을 결정하는 방법론이 설명되어 있는데, 이는 형광 현미경검사법에 따른 꽃가루 관의 현장 및 실험실 오염물질 및 관찰과 PCR에 의한 S-유전자형 식별 및 수분제 선택을 위한 꽃의 모니터링을 결합한 것입니다.

현상학 모니터링, 손 오염, 형광 현미경 검사법 및 분자 지노티핑에 의한 일본 매화의 수분 요구 사항 수립

The Japanese plum cultivars commonly grown are interspecific hybrids derived from crosses between the original Prunus salicina with other Prunus species. ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

3.0K 조회수.  Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA). 일본 매화형 하이브리드의 수분 요건 을 결정하는 방법론이 설명되어 있는데, 이는 형광 현미경검사법에 따른 꽃가루 관의 현장 및 실험실 오염물질 및 관찰과 PCR에 의한 S-유전자형 식별 및 수분제 선택을 위한 꽃의 모니터링을 결합한 것입니다.

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Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

Setaria viridis is an emerging model system for C4 grasses. It is closely related to the bioenergy feed stock switchgrass and the grain crop foxtail millet. Recently, the 510 Mb genome of foxtail millet, S. italica, has been sequenced 1,2 and a 25x coverage genome sequence of the weedy relative S. viridis is in progress. S. viridis has a number of characteristics that make it a potentially excellent model genetic system including a rapid generation time, small stature, simple growth requirements, prolific seed production 3 and developed systems for both transient and stable transformation 4. However, the genetics of S. viridis is largely unexplored, in part, due to the lack of detailed methods for performing crosses. To date, no standard protocol has been adopted that will permit rapid production of seeds from controlled crosses.
The protocol presented here is optimized for performing genetic crosses in S. viridis, accession A10.1. We have employed a simple heat treatment with warm water for emasculation after pruning the panicle to retain 20-30 florets and labeling of flowers to eliminate seeds resulting from newly developed flowers after emasculation. After testing a series of heat treatments at permissive temperatures and varying the duration of dipping, we have established an optimum temperature and time range of 48 &deg;C for 3-6 min. By using this method, a minimum of 15 crosses can be performed by a single worker per day and an average of 3-5 outcross progeny per panicle can be recovered. Therefore, an average of 45-75 outcross progeny can be produced by one person in a single day. Broad implementation of this technique will facilitate the development of recombinant inbred line populations of S. viridis X S. viridis or S. viridis X S. italica, mapping mutations through bulk segregant analysis and creating higher order mutants for genetic analysis.

Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

We have developed a methodology for performing crosses in Setaria viridis (S. viridis). The method involves pruning the panicle prior to a hot water treatment to kill viable pollen. Crosses are performed following a well-controlled growth regime and typically result in the recovery of 1 to 7 cross-pollinated seed/s per panicle.

에 십자가를 수행하는 방법<em&gt; 강아지풀</em목초에 대한&gt;, 새로운 모델 시스템

Setaria viridis is an emerging model system for C4 grasses. It is closely related to the bioenergy feed stock switchgrass and the grain crop foxtail ...

연구

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Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

발생학

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient utilization by avian embryos during development. Fertilized Japanese quail eggs were incubated at 37 &#176;C for 5 days and then yolk sac membranes (YSM) were collected to establish the EEC culture system. We isolated the embryonic endoderm layer from YSM, and sliced the membrane into 2 - 3 mm pieces and partially digested with collagenase before seeding in 24-well culture plates. The EECs proliferate out of the tissue and are ready for cell culture studies. We found that the EECs had typical characteristics of YSM in vivo, for example, accumulation of lipid droplets, expression of sterol O-acyltransferase and lipoprotein lipase. The partial digestion treatment significantly increased the successful rate of EEC culture. Utilizing the EECs, we demonstrated that the expression of SOAT1 was regulated by the cAMP dependent protein kinase A related pathway. This primary Japanese quail EEC culture system is a useful tool to study embryonic lipid transportation and to clarify the role of genes involved in mediating nutrient utilization in YSM during avian embryonic development.

To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.

일본 메추라기 배아의 노 른 골목 막에서 차 내배엽 상피 세포 배양

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Field Experiments of Pollination Ecology: The Case of Lycoris sanguinea var. sanguinea

Plant-pollinator interactions have been studied for approximately one hundred years. During that time, many field methods have been developed to clarify the pollination effectiveness of each pollinator for visited flowers. Pollinator observations have been one of the most common methods to identify pollinators, and bagging and cage experiments have been conducted to show the effectiveness of specific pollinators. In a previous study of Lycoris sanguinea var. sanguinea, its effective pollinators, the visitation frequencies of each floral visitor, and its reproductive strategies were not identified. This study reports the observation that small bees visited flowers that were partially opened (breaking buds). To the best of our knowledge, this phenomenon has not been reported previously. Further, this study investigates the hypothesis that small bees can pollinate at that flowering stage. This study demonstrates the basic methods of field experiments in pollination ecology using L. sanguinea var. sanguinea. Pollinator observations and digital video showed the visitation frequencies of each floral visitor. Bagging and cage experiments revealed that these flowers could be pollinated fully and that breaking-bud pollination could be important for the pollination of this plant species. The advantages and disadvantages of each method are discussed, and recent developments, including laboratory experiments, are described.

Field Experiments of Pollination Ecology: The Case of Lycoris sanguinea var. sanguinea

To reveal the pollinator effectiveness of a given plant species, multiple methods of field experiments have been developed. This study demonstrates the basic methods of field experiments for pollination ecology using the case study of Lycoris sanguinea var. sanguinea and the novel pollination mechanism, breaking-bud pollination.

수분 (受粉) 생태학의 필드 실험 :의 케이스<em&gt; 상사화 sanguinea</em&gt; VAR.<em&gt; sanguinea</em

Plant-pollinator interactions have been studied for approximately one hundred years. During that time, many field methods have been developed to clarify ...

Forced Flowering in Mandarin Trees under Phytotron Conditions

Phytotron has been widely used to assess the effect of numerous parameters on the development of many species. However, less information is available on how to achieve fast profuse flowering in young fruit trees with this plant growth chamber. This study aimed to outline the design and performance of a fast clear methodology to force flowering in young mandarin trees (cv. Nova and cv. Clemenules) and to analyze the influence of induction intensity on inflorescence type. The combination of a short water stress period with simulated spring conditions (day 13 h, 22 &#176;C, night 11 h, 12 &#176;C) in the phytotron allowed flowers to be obtained only after 68-72 days from the time the experiment began. Low-temperature requirements were adequately replaced with water stress. Floral response was proportional to water stress (measured as the number of fallen leaves): the greater the induction, the larger the quantity of flowers. Floral induction intensity also influenced inflorescence type and dates for flowering. Details on artificial lighting (lumens), photoperiod, temperatures, plant size and age, induction strategy and days for each stage are provided. Obtaining flowers from fruit trees at any time, and also several times a year, can have many advantages for researchers. With the methodology proposed herein, three, or even four, flowering periods can be forced each year, and researchers should be able to decide when, and they will know, the duration of the entire process. The methodology can be useful for: flower production and in vitro pollen germination assays; experiments with pests that affect early fruit development stages; studies on fruit physiological alterations. All this can help plant breeders to shorten times to obtain male and female gametes to perform forced-crosses.

Here, we present a protocol to force flowering in mandarin trees under phytotron conditions. Water stress, high illuminance and a simulated spring photoperiod allowed viable flowers to be obtained in a short period of time. This methodology allows researchers to have several flowering periods in 1 year.

강제 Phytotron 조건 만다린 나무 꽃

Phytotron has been widely used to assess the effect of numerous parameters on the development of many species. However, less information is available on ...

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses with an egg cell or a central cell. Thus, two independent fertilization events take place almost simultaneously. The fertilized egg cell and central cell develop into zygote and endosperm, respectively. Therefore, precise control of double fertilization is essential for the ensuing seed development. Double fertilization occurs in the female gametophyte (embryo sac), which is deeply hidden and covered with thick ovule and ovary tissues. This pistil tissue construction makes observation and analysis of double fertilization quite difficult and has created the present situation in which many questions regarding the mechanism of double fertilization remain unanswered. For the functional evaluation of a potential candidate for fertilization regulator, phenotypic analysis of fertilization is important. To judge the completion of fertilization in Arabidopsis thaliana, the shapes of fluorescence signals labeling sperm nuclei are used as indicators. A sperm cell that fails to fertilize is indicated by a condensed fluorescence signal outside of the female gametes, whereas a sperm cell that successfully fertilizes is indicated by a decondensed signal due to karyogamy with the female gametes&#8217; nucleus. The method described here provides a tool to determine successful or failed fertilization under in vivo conditions.

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

We demonstrate a method to determine successful or failed fertilization on the basis of sperm nuclear morphology in Arabidopsis double fertilization using an epifluorescence microscope.

애기장의 정자 핵 형태를 추적하여 수정 상태의 평가 이중 수정

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Determination of Self- and Inter-(in)compatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses

Self-incompatibility in Rosaceae is determined by a Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) that is mainly controlled by the multiallelic locus S. In apricot, the determination of self- and inter-(in)compatibility relationships is increasingly important, since the release of an important number of new cultivars has resulted in the increase of cultivars with unknown pollination requirements. Here, we describe a methodology that combines the determination of self-(in)compatibility by hand-pollinations and microscopy with the identification of the S-genotype by PCR analysis. For self-(in)compatibility determination, flowers at balloon stage from each cultivar were collected in the field, hand-pollinated in the laboratory, fixed, and stained with aniline blue for the observation of pollen tube behavior under the fluorescence microscopy. For the establishment of incompatibility relationships between cultivars, DNA from each cultivar was extracted from young leaves and S-alleles were identified by PCR. This approach allows establishing incompatibility groups and elucidate incompatibility relationships between cultivars, which provides a valuable information to choose suitable pollinizers in the design of new orchards and to select appropriate parents in breeding programs.

Determination of Self- and Inter-incompatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses

We present a methodology to establish the pollination requirements of apricot (Prunus armeniaca L.) cultivars combining the determination of self-(in)compatibility by fluorescence microscopy with the identification of the S-genotype by PCR analysis.

손 수분, 현미경 검사법 및 유전자 분석을 결합한 살구의 자기 및 간 호환성 관계 결정

Self-incompatibility in Rosaceae is determined by a Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) that is mainly controlled by the multiallelic locus S. ...

Live Imaging of Arabidopsis Pollen Tube Reception and Double Fertilization Using the Semi-In Vitro Cum Septum Method

In flowering plants, the growth and guidance of the pollen tube (male gametophyte) within the pistil and the reception of the pollen tube by the female gametophyte are essential for double fertilization and subsequent seed development. The interactions between male and female gametophytes during pollen tube reception culminate in pollen tube rupture and the release of two sperm cells to effect double fertilization. As pollen tube growth and double fertilization are deeply hidden within the tissues of the flower, this process is difficult to observe in vivo.
A semi-in vitro (SIV) method for the live-cell imaging of fertilization in the model plant Arabidopsis thaliana has been developed and implemented in several investigations. These studies have helped to elucidate the fundamental features of how the fertilization process occurs in flowering plants and which cellular and molecular changes occur during the interaction of the male and female gametophytes. However, because these live cell imaging experiments involve the excision of individual ovules, they are limited to a low number of observations per imaging session, making this approach tedious and very time-consuming. Among other technical difficulties, a failure of the pollen tubes to fertilize the ovules in vitro is&#160;often reported, which severely confounds such analyses.
Here, a detailed video protocol for the imaging of pollen tube reception and fertilization in an automated and high-throughput manner is provided, allowing for up to 40 observations of pollen tube reception and rupture per imaging session. Coupled with the use of genetically encoded biosensors and marker lines, this method enables the generation of large sample sizes with a reduced time investment. Nuances and critical points of the technique, including flower staging, dissection, medium preparation, and imaging, are clearly detailed in video format to facilitate future research on the dynamics of pollen tube guidance, reception, and double fertilization.

Live Imaging of Arabidopsis Pollen Tube Reception and Double Fertilization Using the Semi-In Vitro Cum Septum Method

Here, we describe an improvement of the semi-in vitro (SIV) method for observing pollen tube guidance and reception in Arabidopsis thaliana,&#160;which increases the receptivity of ovules. The high-throughput SIV cum septum method may be coupled with gametophyte marker lines and genetically encoded biosensors to monitor the dynamic process of fertilization.

Arabidopsis 꽃가루관 수용 및 이중 수정의 실시간 이미징 semi-In vitro cum septum 방법을 사용한

In flowering plants, the growth and guidance of the pollen tube (male gametophyte) within the pistil and the reception of the pollen tube by the female ...

생물학

Determination of Self-(In)compatibility and Inter-(In)compatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

Citrus uses S-RNase-based self-incompatibility to reject self-pollen and, therefore, requires nearby pollinizer trees for successful pollination and fertilization. However, identifying suitable varieties to serve as pollinizers is a time-consuming process. To solve this problem, we have developed a rapid method for identifying pollination-compatible citrus cultivars that utilizes agarose gel electrophoresis and aniline blue staining. Pollen compatibility is determined based on the identification of S genotypes by extracting total DNA and performing PCR-based genotyping assays with specific primers. Additionally, styles are collected 3-4 days after manual pollination, and aniline blue staining is performed. Finally, the growth status of the pollen tubes is observed with a fluorescence microscope. Pollen compatibility and incompatibility can be established by observing whether the pollen tube growth is normal or suppressed, respectively. Due to its simplicity and cost-effectiveness, this method is an effective tool for determining the pollen compatibility and incompatibility of different citrus varieties to establish incompatibility groups and incompatibility relationships between different cultivars. This method provides information essential for the successful selection of suitable pollinizer trees and, thus, facilitates the establishment of new orchards and the selection of appropriate parents for breeding programs.

Determination of Self-Incompatibility and Inter-Incompatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

This protocol provides a rapid method for determining pollen compatibility and incompatibility in citrus cultivars.

수동 수분, 현미경 및 S-유전자형 분석을 사용한 감귤류의 자체 (in)호환성 및 inter-(in)compatibility 관계 결정

Citrus uses S-RNase-based self-incompatibility to reject self-pollen and, therefore, requires nearby pollinizer trees for successful pollination and ...

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애기장대(Arabidopsis thaliana)의 꽃가루 수화 프로필을 측정하는 개선된 방법

A High-Resolution, Single-Grain, In Vivo Pollen Hydration Bioassay for Arabidopsis thaliana

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is established between the interacting partners. Studies across a range of species have revealed that a series of molecular checkpoints regulate the pollen-stigma interaction to ensure that only compatible, generally intraspecific pollen is successful in effecting fertilization. In species that possess a 'dry stigma', such as the model plant Arabidopsis thaliana, the first post-pollination, prezygotic compatibility checkpoint is the establishment of pollen hydration. 
This phase of pollination is tightly regulated, whereby signals from the pollen grain elicit the release of water from the stigma, thus permitting pollen hydration. The ability to accurately measure and track pollen hydration over time is key to the design of experiments directed at understanding the regulation of this critical step in reproduction. Published protocols frequently utilize flowers that have been excised from the parent plant, maintained on liquid or solid media, and bulk pollinated. 
This paper describes a noninvasive, in vivo pollination bioassay that permits minute-by-minute hydration tracking of individual A. thaliana pollen grains at high resolution. The assay is highly reproducible, able to detect very subtle variations of pollen hydration profiles, and thus is suitable for the analysis of mutants that affect pathways regulating pollination. Although the protocol is lengthier than those described for bulk pollinations, the precision and reproducibility it provides, along with its in vivo nature, make it ideal for the detailed dissection of pollination phenotypes.

저자 스포트라이트: Arabidopsis thaliana에 대한 고해상도, 단일 곡물, 생체 내 꽃가루 수화 생물검정  

An improved method to measure pollen hydration profiles in Arabidopsis thaliana is described here. The new method offers higher resolution, is noninvasive, and is highly reproducible. The protocol represents a new tool for a finer dissection of the processes that regulate the early stages of pollination.

Arabidopsis thaliana에 대한 고분해능, 단일 입자, 생체 내 꽃가루 수화 생물학적 분석

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is ...

현상학 모니터링, 손 오염, 형광 현미경 검사법 및 분자 지노티핑에 의한 일본 매화의 수분 요구 사항 수립

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에 십자가를 수행하는 방법