이 방법은 영상 세션당 높은 샘플 크기 수와 높은 효율성으로 배우식물 상호작용을 관찰할 수 있도록 함으로써 애기장대의 유성 생식에 대한 연구를 용이하게 할 것입니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 중격에 난자를 유지함으로써 난자의 양과 수용성이 이전 방법에 비해 크게 증가한다는 것입니다. 해부 기술은 처음에는 어려울 수 있으며 꾸준한 손이 필요합니다.
따라서 실험을 시작하기 전에 거세된 암술에 대해 몇 번 연습하는 것이 좋습니다. 본문에 설명 된대로 꽃가루 발아 배지를 준비하는 것으로 시작하십시오. 한천이 완전히 용융된 후, 130 마이크로리터의 배지를 35 밀리미터 유리 바닥 접시의 14 밀리미터 웰 내로 피펫팅한다.
매체가 우물을 덮을 때까지 접시를 돌립니다. 피펫을 사용하여 접시 중앙에서 40마이크로리터의 배지를 흡인하고 90마이크로리터의 배지를 남깁니다. 매체의 균일한 냉각을 보장하려면 플레이트를 섭씨 4도에서 밤새 보관하기 전에 습도 챔버의 알루미늄 블록에서 접시를 식히십시오.
이미징 전날 아침, 최근에 중격 기증자 및 낙인 기증자로 생산되기 시작한 건강한 애기장대 식물을 선택하십시오. 수술, 꽃받침 및 꽃잎을 제거하여 3단계 12B 중격 기증자 꽃과 12단계 12B 낙인 기증자 꽃을 거세하기 전에 꽃차례에서 오래된 꽃을 제거합니다. 24시간 후 아침에 쉽게 꽃가루를 흘리는 꽃가루 기증자 꽃으로 낙인 기증자에게 수분을 공급합니다.
낙인이 꽃가루로 거의 완전히 덮여있을 때 수분이 완료됩니다. 수분 30분 후, 척추경에서 건강하고 성숙한 중격 기증자 암술을 제거하고 테이프 가장자리 바로 옆에 낙인이 붙어 있는 유리 슬라이드에 장착된 신선한 양면 접착 테이프에 넣습니다. 새 인슐린 주사기 바늘의 뒷면을 사용하여 척추경을 부드럽게 누르고 난소를 따라 암틀을 테이프에 단단히 고정합니다.
꽃받침, 꽃잎 및 수술 찌꺼기를 제거합니다. 입체경 아래에서 인슐린 주사기 바늘을 사용하여 스타일-난소 접합부와 난소-척추경 접합부에서 심피당 두 번 절단합니다. 그런 다음 각 심피의 중격을 따라 얕게 자르고 난소 벽을 테이프에 다시 벗겨 난자를 노출시킵니다.
두 개의 격막 사이에 바늘을 부드럽게 밀어 난자를 방해하지 않고 암술의 전체 길이를 따라 replum을 자릅니다. 그런 다음 스타일 근처의 상단 중격을 잘라 전체 중격이 들어 올려지도록 합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 척추경에서 중격을 제거합니다.
난자의 미세 더미가 위를 향하도록 배지에 중격을 가능한 한 평평하게 놓습니다. 그런 다음 난자가 배지에 약간 묻힐 때까지 중격을 부드럽게 누릅니다. 수분된 암술머리 기증자 암술을 유리 슬라이드에 장착된 신선한 양면 접착 테이프에 올려 난소 스타일 접합부가 테이프 가장자리에서 떨어지도록 합니다.
면도날을 사용하여 스타일을 똑바로 자르고 면도날에 부착된 낙인으로 들어 올립니다. 인슐린 주사기 바늘로 칼날에서 암술머리를 제거하고 난자에서 약 250-300 마이크로 미터 떨어진 곳에 평평하게 놓습니다. 최대 12개의 암술머리를 옮기고 각 중격의 양쪽에 2개를 배치합니다.
섭씨 21도의 상대 습도 92%로 유지되는 현미경의 습도 챔버에서 배양한 후 접시를 이미징할 준비가 됩니다. 낮은 광도의 명시야 아래에서 샘플에 초점을 맞춘 다음 형광등으로 전환합니다. 다음으로, 이미지화할 스테이지 개요에 샘플 영역을 표시합니다.
완료되면 각 개요 영역의 시작 부분에 자동 초점 기능이 있는 다단계 획득 체계를 사용하여 이미징을 시작합니다. 부화 후 약 7-9 시간 후에 꽃가루 튜브가 난자에 끌리고 받아 들여지는지 확인하십시오. 성공적인 꽃가루 튜브 수신은 난자의 미세 더미에서 꽃가루 튜브의 폭발적인 파열을 보여줍니다.
완료되면 획득을 중지합니다. 반 시험관 내 절제 난자 방법의 8가지 기술적 복제가 수행되었고 성공적인 꽃가루 튜브 수용을 위해 점수가 매겨졌습니다. 녹색 사각형은 성공적인 수신을 나타내고 빨간색 사각형은 수신 결함을 나타냅니다.
이 실험은 난자의 약 28%가 폭발적인 꽃가루 튜브 파열을 보여 약 10-50% 범위의 효율을 나타내는 것으로 나타났습니다.반 시험관 겸 중격 방법을 사용하여 더 많은 에일 난자를 채점할 수 있었고 녹색 사각형이 있는 난자에서 볼 수 있듯이 한 이미징 세션에서 최대 40개의 성공적인 꽃가루 튜브 수용 사례가 기록되었습니다. 이 방법의 5가지 기술적 복제는 꽃가루 관을 끌어당기는 난자의 약 79%가 폭발적인 꽃가루 관 파열을 보여 약 70에서 100% 범위의 효율을 나타내므로 꽃가루 관이 파열되면 수용 시너지 효과의 핵이 1분의 분해능으로 동시에 분해되는 것으로 관찰되었습니다. karyogamy 후, 난자 세포핵이 마이크로 더미쪽으로 이동하는 것이 보였다.
좌측 및 우측 시너지 모두 수용 시너지 효과를 낼 수 있었다. 이 방법의 성공을 위해 주의해야 할 중요한 요소는 병기 결정, 새로 준비된 배지 사용, 배지에 난자 삽입, 높은 습도 유지 및 낮은 광독성 보장입니다. 또한 이 기술을 이광자 여기 이미징과 결합하여 배우자 상호 작용 중에 발생하는 생리학적 및 세포학적 변화를 면밀히 관찰할 수 있습니다.
난자를 고정하여 전자 현미경과 결합할 수도 있습니다.
