이 프로토콜은 실시간으로 세포 외 매트릭스로 암세포의 침입을 지배하는 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 스페로이드 침입 분석법을 쉽게 설정하고 효율성과 비용을 향상시키는 간단한 스페로이드 이미징 장치를 사용한다는 것입니다. 우리는 유방 암종을 모델링하기 위해 스페로이드 침입 분석기를 사용하여 시연하는 동안,이 분석은 주변 의 건강한 조직에 어떤 고형 종양의 침입을위한 훌륭한 모델입니다.
스페이서의 3D 프린팅 후, 플라스틱 컵에서 크로스 링커에 기본 폴리머의 10:1 비율을 밖으로 무게와 철저하게 컵에 결과 PDMS 솔루션을 혼합 일회용 파이펫을 사용합니다. 컵을 진공 챔버에 넣고 진공 압력을 신속하게 방출하여 혼합물 표면에 갇힌 공기를 제거하고 나머지 기포를 방출합니다. 3D 프린팅 스페이서를 섭씨 100도에서 5분간 배양하여 유연성을 높이고 100%의 이소프로파놀로 두 개의 유리 판을 청소합니다.
스페이서를 두 개의 청소된 플레이트 사이에 플러시하고 두 개의 큰 바인더 클립을 아래쪽 가장자리에 놓고 상단 모서리에 두 개의 큰 바인더 클립을 배치하여 금형을 플레이트의 바깥쪽 가장자리에 밀봉합니다. 금형의 상단 부분을 검사하여 스페이서가 유리 판으로 플러시되도록 하고 팁에서 약 2센티미터 잘라낸 일회용 파이펫을 사용하여 천천히 하지만 지속적으로 PDMS 혼합물을 금형의 왼쪽 상단 모서리에 추가합니다. 전체 금형이 채워지면 금형을 진공 챔버에 넣고 형성된 기포를 제거한 후 100°C에서 1시간 동안 PDMS를 경화합니다.
인큐베이션의 끝에, 실온에서 금형을 배치합니다. 터치가 식으면 경화 PDMS를 포함하는 스페이서에서 바인더 클립과 유리 판을 제거하고 면도날을 사용하여 스페이서와 유리 판 사이의 금형의 네 면 모두에 생성된 씰을 잘라냅니다. 금형을 분리하여 스페이서에 PDMS 시트를 표시하고 핀셋을 사용하여 스페이서에서 PDMS 시트를 조심스럽게 벗깁니다.
시트를 커팅 매트에 놓고 생검 펀치를 사용하여 17.5밀리미터 직경의 PDMS 디스크를 펀치한 다음 5.5mm 구멍을 고르게 분산하여 디스크에 펀치합니다. 테이프를 사용하여 각 인서트에서 먼지 입자를 제거하고 청소된 인서트를 양면 테이프 조각에 고정합니다. 테이프를 10센티미터 페트리 접시 뚜껑에 감싸고 뚜껑을 플라즈마 기계에 넣고 35mm 유리 바닥 접시를 엽니다.
300밀리터에서 1분간의 플라즈마 처리로 인서트와 유리를 활성화하고 핀셋을 사용하여 각 인서트의 처리된 측면을 인서트당 1개의 처리된 유리 부분의 유리 부분에 신속하게 부착합니다. 모든 인서트가 적용된 경우 포인터 손가락과 엄지 손가락을 사용하여 접시를 회전시키면서 각 인서에 압력을 가하여 접시에 인서트를 단단히 부착합니다. 모든 인서트가 확보되면, 입증된 바와 같이 2차 플라즈마 처리를 수행하기 전에 결과 스페로이드 이미징 장치를 섭씨 60도에서 20분 동안 배양한다.
두 번째 처리 후, 각 삽입 구멍에 갓 준비 된 코팅 용액 35 마이크로 리터를 추가합니다. 실온에서 1 시간 후, 코팅 용액을 제거하고 증류수로 장치를 세 번 헹구는다. 마지막 세척 후, 실온에서 30 분 배양에 대한 각 구멍에 교차 연결 솔루션의 35 마이크로 리터를 추가합니다.
인큐베이션이 끝나면, 각 장치를 UV 빛 아래에서 30분 동안 70%에탄올로 채우기 전에 입증된 대로 증류수로 장치를 세 번 헹구는 다. 멸균이 끝나면 증류수로 장치를 세 번 헹구고 각 장치에 2.5 밀리리터의 저장 솔루션을 추가합니다. 콜라겐에 스페로이드를 포함하려면 세척당 PBS 3밀리리터로 장치를 세 번 세척합니다.
마지막 세척 후, 장치가 완전히 건조 할 수 있도록, 삽입의 한 구멍에 갓 준비 된 대학 하나의 솔루션의 30 마이크로 리터에 하나의 스페로이드를 추가하고 타이머를 시작하기 전에. 구멍에 스페로이드의 존재를 확인한 후, 입증된 대로 다른 두 구멍에 스페로이드를 추가합니다. 10 마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여 PDMS 테두리 근처에 있는 모든 스페로이드를 다시 중앙에 배치하거나 여러 스페로이드를 분배하고 타이머를 중지하는 경우 스페로이드를 분리합니다.
콜라겐 층에서 스페로이드를 수직으로 중심으로, 시드 후, 장치를 거꾸로 뒤집어 콜라겐이 중합화될 때까지 장치를 37도에서 배양하고, 총 30분 동안 2분마다 장치 방향을 반전한 다음, 장치당 2.5 밀리리터의 매체를 추가하고 0시간 지점에서 스퍼로이드 의 이미지를 획득한다. 스페로이드 이미지 장치를 사용하면 콜라겐 내 또는 세로 이미징을 통해 암세포 침입의 효율적인 포함 및 시간 경과 기록을 용이하게 합니다. 이 스페로이드는 세포질 및/또는 핵 형광 단백질의 안정적인 발현을 요구하는 6일 동안 세로로 이미지되었지만, 유사한 세로 화상 진찰은 염료 라벨링을 사용하여 짧은 기간 동안 수행될 수 있다.
스페로이드는 또한 고정및 면역 표지될 수 있습니다. 예를 들어, 이러한 스페로이드는 상피-카데린, 코타틴 및 F-액틴용 면역 라벨을 부착했다. 이러한 이미지에서, 시간이 지남에 따라 스페로이드의 영역을 측정하기 위해 피지 매크로를 사용하여 이미지 처리 절차의 단계별 그림을 관찰할 수 있다.
스페로이드 이미징 장치의 각 구멍에 단일 스페로이드를 분배하고 XY 및 Z 방향 모두에서 구멍의 중앙에 스페로이드를 배치해야합니다. 장치 설계는 더 높은 스페로이드 처리량을 수용하기 위해 구멍, 인서트 및 유리 바닥 접시의 크기와 배열을 변경하여 쉽게 수정할 수 있습니다.
