이 프로토콜은 다양한 연구 및 세포 기반 치료 응용 분야에 대한 생체 분자를 효율적으로 전달할 수 있는 유동유체 시스템의 조립 및 작동을 설명합니다. 이 시스템의 주요 장점은 생존력을 유지하면서 세포에 생체 분자를 신속하게 전달할 수 있다는 것입니다. 암 치료와 같은 다양한 세포 치료 응용 분야에서 세포를 변형시킬 수 있는 플랫폼 기술입니다.
먼저 54그램의 PDMS 베이스와 6그램의 경화제를 컵에 결합합니다. 주걱과 1분 이상 격렬하게 섞은 다음, PDMS 용액을 가진 컵을 약 30분 동안 건조기또는 잔재기 기포가 제거될 때까지 건조기에 넣습니다. 포토레지스트 코팅 웨이퍼를 150mm 페트리 접시에 위쪽으로 향하는 패턴으로 놓고 PDMS 용액을 금형 위에 붓습니다.
필요한 경우 페트리 접시를 건조기 안에 놓고 잔재된 기포가 사라질 때까지 진공을 적용합니다. 페트리 접시를 실험실 오븐에 옮기고 60°C에서 2시간 동안 구워 PDMS를 치료합니다. 경화 후 면도칼로 웨이퍼 가장자리를 잘라페트리 접시에서 PDMS를 조심스럽게 제거합니다.
칼이나 면도날을 사용하여 각 개별 장치를 잘라낸 다음 2.5mm 생검 펀치를 사용하여 입구및 콘센트 포트를 통해 구멍을 뚫습니다. PDMS 장치를 산소 플라즈마로 치료한 후 각 장치를 유리 표면을 향한 채널이 있는 깨끗한 소다 라임 유리 현미경 슬라이드에 즉시 배치합니다. 장치가 실온에서 하룻밤 동안 결합되도록 허용합니다.
1센티미터 직경의 압압 트랜스듀서표면에 실리콘을 1~2밀리미터 두께로 부드럽게 적용한 다음, 트랜스듀서를 동심 나선형으로 조심스럽게 정렬하고 유리 현미경 슬라이드의 바닥에 부드럽게 누릅니다. USB A ~ B 케이블을 사용하여 컴퓨터에 마이크로 컨트롤러를 연결합니다. 녹색 전원 LED 표시등이 켜져야 합니다.
컴퓨터에서 연결된 소프트웨어를 사용하여 8메가헤르츠 신호를 생성하는 프로그램을 업로드합니다. PZT 트랜스듀서의 각 와이어 의 끝으로 1 인치 22 게이지 와이어를 납땜. 그런 다음 PZT 트랜스듀서의 음수 단말 와이어를 GND 핀에 연결하도록 사용합니다.
PZT 트랜스듀서의 양수 단말 와이어를 납땜 와이어를 통해 출력 핀에 연결합니다. 타이곤 PVC 소프트 플라스틱 튜브의 3~6인치 섹션을 잘라 입구와 콘센트 포트에 튜브를 밀어 넣습니다. 개구부에 맞을 때까지 압력을 가하면서 튜브를 회전해야 할 수도 있습니다.
선택적으로, 접착제는 PDMS와 튜브를 함께 결합하기 위해 접합에 적용 할 수 있습니다. 선택적으로, 3D 인쇄 케이스에 acoustofluidic 장치 및 마이크로 컨트롤러를 장착합니다. 제조업체의 지침에 따라 미세 유체 저장소를 조립합니다.
1/16 인치 내경 타이곤 PVC 소프트 플라스틱 튜브의 3 ~ 6 인치 섹션을 잘라 미세 유체 저수지 출력에서 1/32 인치 내부 직경 튜브를 통해 밀어 넣습니다. 선택적으로, 누출을 방지하기 위해 파라핀 필름으로 접합을 감쌉니다. 60 밀리리터 주사기를 미세 유체 저수지 측면에 주변 공기로 채웁니다.
주사기 펌프를 시간당 200 밀리리터의 속도로 설정하여 시간당 50 밀리리터의 체적 유량으로 유동 장치를 통해 조영제 용액을 밀어 내고 장치의 출력에서 샘플을 50 밀리리터 원심분리기 튜브로 수집합니다. DSPC 25밀리그램, DSEPC 11.6밀리그램, DSPG 0.26밀리그램, 폴리옥세틸렌40 stearate 0.88 밀리그램을 추가하여 20밀리리터 신틸레이션 바이알로 phopholipid 용액을 준비합니다. 모든 인지질이 용해될 때까지 클로로폼을 추가합니다.
건조 지질 필름을 형성하기 위해 48 시간 동안 건조기에서 엽록소포를 증발시다. 멸균 PBS의 10 밀리리터로 거품을 다시 수화한 다음 지질 용액을 40% 진폭으로 3분간 초음파 처리하여 양이온 미셀라 용액을 형성합니다. 초음파 처리 후, phopholipid 용액은 최대 1 개월 동안 섭씨 2 ~ 6도에 저장 될 수 있습니다.
초음파 조영제를 준비하려면 멸균 PBS 600 마이크로리터에 2밀리리터 유리 중격 바이알에 200 마이크로리터를 첨가합니다. 캡을 압착하여 바이알을 밀봉합니다. 1.5 인치 20 게이지 바늘을 사용하여 유리병 헤드 공간을 데카플루오로부탄 가스로 30초 동안 채웁니다.
병균을 분리하여 퍼플루오로부탄 가스로 채워진 초음파 조영제. 세포 용액의 1 밀리리터 당 초음파 조영제 용액 25 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 즉시 결합된 조영제 및 세포 혼합물을 유동유체 장치를 통해 펌핑한다.
이 프로토콜은 여러 세포주에서 세포내 분자 전달을 향상시키는 데 사용할 수있는 acoustofluidic 시스템을 생성합니다. 형광 화합물의 세포내 전달, 형광체, 1 차 인간 T 세포에 치료되지 않은 대조군에 비해 acoustofluidic 치료와 함께 개선되었다. T 세포의 형광 강도는 치료 후 5 배 증가하여 형광의 향상된 전달을 나타냅니다.
세포 생존력은 혼수상태 치료 후 약간 감소했지만, 인간 A549 폐암종 세포에 대한 방부제 화합물 trehalose의 세포내 전달을 강화한 80%이상의 유동적 치료와 치료되지 않은 대조군의 세포에 머물렀다. 세포 용액에 양이온 마이크로 버블을 추가하는 것이 중요합니다. 생체 분자의 세포 내 전달은 용액에서 양이온 마이크로 버블없이 제한됩니다.
이 플랫폼은 연구 또는 치료 목적으로 세포 기능을 변경할 수있는 다양한 생체 분자의 세포 내 전달을 가능하게합니다. 이 절차를 완료 한 후, 추가 세포 특성은 다양한 생체 분자를 전달하는 영향을 평가하기 위해 수행 될 수있다.
