세포 역학은 종양 전이, 세포의 악성 형질 전환 및 방사선 민감성에 중요한 역할을합니다. 음향 유체 방법은 정지 상태에서 빠르고 비파괴적인 측정을 실현할 수 있습니다. 이 기술은 상피에서 중간엽으로의 전이 동안 자가 압축성의 변화를 미러링하고 순환 종양 세포를 분리하는 데 사용할 수 있어 암 진단에 적용 가능성을 보여줍니다.
시작하려면 1mm 직경의 중공 바늘로 입구 및 출구 포트용 PDMS 블록에 구멍을 뚫어 PDMS 블록을 칩에 바인딩합니다. 그런 다음 PDMS 블록과 칩을 뒷면이 위로 향하게 하여 플라즈마 클리너에 1분 동안 넣습니다. PDMS 블록의 구멍을 칩 입구 및 출구에 맞춘 후 PDMS 블록을 칩에 15초 동안 부드럽게 누르면 PDMS 블록과 칩 표면 사이에 본딩이 발생합니다.
PTFE 카테터를 칩에 연결하려면 내경이 0.8mm이고 길이가 10cm 인 카테터 두 개를 자릅니다. 내경 0.7mm, 길이 1.5cm x 90도 인 스테인레스 스틸 바늘을 L 자 모양으로 구부려 카테터의 한쪽 끝에 연결합니다. 스테인리스 스틸 바늘을 PDMS 블록의 구멍에 삽입합니다.
입구의 경우 19 게이지 분배 바늘을 주사기 용 커넥터로 카테터의 다른 쪽 끝에 연결합니다. 그런 다음 탈이온수를 주입하여 전체 채널의 견고성을 테스트합니다. 압전 세라믹 어셈블리의 경우 너비가 5mm인 사전 절단된 압전 세라믹 시트를 선택하십시오.
그런 다음 한쪽 끝에서 압전 세라믹의 양쪽에 와이어를 용접하십시오. 압전 세라믹에 시아 노 아크릴 레이트 접착제 한 방울을 놓아 압전 세라믹을 칩 뒷면 중앙에 붙입니다. 이쑤시개로 접착제를 부드럽게하고 여분의 접착제를 제거하십시오.
그런 다음 칩에서 빠르게 누르고 약 1 분 동안 계속 누릅니다. 마이크로 장치를 장착하려면 PDMS를 마이크로 장치의 베이스로 자르고 베이스의 한쪽을 입구 및 출구 PDMS 블록에 붙이고 다른 쪽을 양면 테이프를 사용하여 투명 유리 슬라이드에 붙입니다. 전체 마이크로 장치를 현미경 스테이지에 고정하여 칩을 하나의 초점면에 유지합니다.
폴리스티렌 표준 입자 용액을 제조하려면 10 밀리리터의 PBS에 0.05 밀리리터의 폴리스티렌 입자 용액을 첨가하고 잘 혼합한다. 그런 다음 부착 세포를 PBS로 90% confluency로 세척하여 세포 현탁액을 준비합니다. 실온에서 1-2 분 동안 0.25 트립신 500 마이크로 리터를 첨가하십시오.
트립신을 제거한 후, 1 밀리리터 완전 배지를 첨가하고 피펫팅에 의해 세포 현탁액을 형성한다. 다음으로 세포 현탁액을 100G에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 제거하고 세포 현탁액을 얻기 위해 0.5 내지 1 밀리리터의 PBS에 재현탁시켰다.
그런 다음 세포를 혈구계로 계수하고 농도는 밀리리터당 약 300 내지 500, 000 세포였다. 이전에 입증된 바와 같이 세포핵 현탁액을 제조한 후, 상청액을 제거하고 20 마이크로리터당 200 마이크로리터의 세포질 단백질 추출 시약 A를 세포 팔레트에 첨가하고 잘 혼합한다. 그런 다음 위의 혼합물을 220G에서 5 초 동안 소용돌이 치고 10 분 동안 얼음 욕조에 두십시오.
다음으로, 배양 후 10 마이크로 리터의 세포질 단백질 추출 시약 B를 용액에 첨가한다. 소용돌이 후 얼음 욕조에 1 분 동안 놓고 220G에서 5 초 동안 다시 소용돌이합니다. 그런 다음 마지막으로 섭씨 4도에서 5 분 동안 1000G에서 원심 분리합니다.
상청액을 제거하고 1 밀리리터의 PBS에 팔레트를 다시 현탁하십시오. 그런 다음 섭씨 4도에서 1000G에서 4 분 동안 원심 분리합니다. 상청액을 제거한 후, 세포핵 현탁액으로서 100 마이크로리터의 PBS에 재현탁시킨다.
위의 세포핵 현탁액에 트리판 블루를 넣고 실온에서 4분 동안 염색합니다. 다음으로, 10x 대물 렌즈로 도립 현미경 아래의 핵 수를 세십시오. 상기 세포핵 현탁액을 PBS 완충액으로 밀리리터당 200 내지 300, 000개의 핵의 농도로 희석한다.
그런 다음 세포핵 현탁액을 70 마이크로 미터 체를 통해 여과합니다. 측정 시스템을 설정하려면 현미경의 광원을 켜고 카메라 소프트웨어를 엽니다. 4x 대물렌즈를 사용하여 마이크로 채널의 중간 위치, 즉 압전 세라믹의 위치를 찾습니다.
전선을 연결 한 후 압전 세라믹의 신호 발생기 출력의 양극 및 음극 단자에 각각 용접하십시오. 그런 다음 주사기를 미세 주입 펌프에 놓고 입구 카테터에 연결합니다. 마이크로 채널에서 유체를 수집하려면 출구 카테터 끝에 작은 용기를 놓습니다.
측정 매개 변수를 결정하려면 주사기로 폴리스티렌 입자 용액을 흡인하십시오. 그런 다음 정확한 측정을 보장하기 위해 기포를 피하면서 칩 마이크로 채널과 칩 마이크로 채널에 용액을 주입합니다. 입자가 마이크로 채널의 정중선을 향해 이동하고 정중선에 도달한 후 정중선을 따라 전진 운동을 유지하는 것이 관찰될 때까지 신호 발생기의 출력을 1메가헤르츠의 주파수와 10V의 피크 대 피크 전압을 갖는 부호 신호로 설정합니다.
1 밀리리터 세포 또는 핵 현탁액을 표준 입자 용액과 1 : 1의 비율로 혼합 한 후 주사기로 마이크로 채널에 주입하여 세포 및 핵을 측정합니다. 세포 또는 핵이 시야에 들어가면 CCD 카메라로 녹화를 시작하고 신호 발생기를 켭니다. 그런 다음 나중에 사용할 수 있도록 마이크로 채널을 탈 이온수, 75 % 알코올 및 탈 이온수로 순서대로 헹굽니다.
세포와 입자의 이동은 상이한 시간 간격으로 마이크로 채널의 정중선을 향한 음장 힘의 작용하에 관찰되었다. 에너지, 밀도 및 셀 압축성의 계산이 수행되었고 음향 에너지 밀도 및 입자에 대한 측정된 운동 궤적이 가장 적합한 결과로부터 얻어졌습니다. 고순도 및 온전한 핵을 세포로부터 분리하고 핵의 운동 궤적을 얻어 핵 압축성 측정을 달성하였다.
상이한 유형의 암세포 및 상이한 선량으로 약물 유도 EMT 또는 X- 레이 조사 후 세포의 압축성을 측정하고 비교하였다. 측정된 세포를 채취한 결과, 배양 48시간 후 미처리군과 비교하여 세포 증식 및 생존율에 유의한 차이가 없음을 알 수 있었다. 압축률 측정이 세포 증식 및 생존에 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
가장 중요한 것은 입자가 마이크로 채널의 정중선을 향해 이동하는 것이 관찰 될 때까지 신호의 주파수를 미세 조정하는 것입니다.
