높은 처리량, 효모 세포에 대한 우리의 프로토콜은 동시에 수천 개의 미세 식민지에 대한 성장과 유전자 발현을 추적 할 수 있습니다. 균주 사이의 차이, 환경 사이와 공유 환경에서 자란 유전적으로 동일한 세포 사이의 차이를 정량화 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 유전자 발현 기자의 평균 성장률과 평균 형광 강도의 정확한 추정치를 산출합니다.
또한, 많은 개별 마이크로콜로니가 분석되기 때문에 성장과 발현 값의 전체 분포에 대한 정확한 추정치가 얻어진다. 이 프로토콜은 두 가지 주요 단계, 실험 판의 준비 및 이미징을 위한 세포의 준비를 따릅니다. 세포는 희석 및 혼합 후 즉시 도금되어야 합니다.
그래서 먼저 실험 판을 설정하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜 을 통해 세포의 반복 혼합을 알 수 있습니다., 도금 까지 단계에 매우 중요 한. 실험 당일, 분석에 사용되는 모든 미디어 및 기타 솔루션은 현미경 이미지에 나타날 수 있는 결정을 제거하기 위해 이미 멸균되더라도 두 개의 미크론 필터로 필터링되어야 합니다.
여기에는 실험 매체와 콩카바린 A 솔루션이 포함됩니다. 다음으로 현미경 플레이트를 준비합니다. 우물의 유리 표면을 이물질과 긁힘에서 제거하기 위해 항상 보풀과 정적 프리 와이프를 플레이트 아래에 보관하십시오.
멸균 된 벤치에 멸균 기술을 사용합니다. 1X Concanavalin A 용액 및 파이펫 200 마이크로리터의 25 밀리리터를 현미경 플레이트의 각 웰에 걸러넣습니다. 적절한 높이를 보장하기 위해 파이펫을 안정시키는 것이 좋습니다.
콘카나베일A가 우물 바닥을 고르게 코팅하는 것을 막을 수 있는 기포를 제거하기 위해 411회 G에서 2분 동안 보풀과 정적 프리 와이프가 있는 현미경 플레이트를 원심분리합니다. Concanavalin A 용액이 들어있는 플레이트가 1 ~ 2 시간 동안 쉬게하십시오. 실험 전반에 걸쳐 일관성을 유지하십시오.
Concanavalin A 인큐베이션 후, 흡입 장치또는 여기에 표시된 대로 판에서 용액을 강제로 덤프하여 96 웰 플레이트에서 Concanavalin A를 치웁울 수 있습니다. 일부 물방울은 유지됩니다. 다음으로, 각 우물에 멸균 수의 400 마이크로 리터를 추가하여 우물을 씻어.
Concanavalin A 용액을 제거한 직후물을 추가합니다. 접시가 건조하게 앉지 마십시오. 우물의 유리 표면에서 Concanavalin A를 대체하거나 제거하지 않으려면 파이펫 팁으로 플레이트의 코팅 된 바닥을 만지지 않는 것이 중요합니다.
Concanavalin A 용액과 동일한 방식으로 물을 제거하고 즉시 현미경 플레이트에 실험 용 매체 185 마이크로 리터를 추가하십시오. 접시가 건조하게 앉는 것을 허용하지 마십시오. 플레이트는 이제 희석 된 세포의 50 마이크로 리터를 추가 할 준비가되어 있습니다.
미리 재배된 무작위 96웰 플레이트를 검색합니다. 실험 질문은 셀이 포화 상태인지 로그 단계에서 인지, 분석에서 사용해야 하는 무작위 복제 수가 있는지 를 결정합니다. 411회 G에서 2분간 플레이트원심분리하여 호일 덮개를 제거할 때 교차 오염 가능성을 최소화합니다.
당신이 그것을 처리 할 때 접시를 기울이지 않도록하십시오. 효모와 미디어가 접시를 덮는 호일과 접촉하면 우물 전체에 오염이 있을 수 있습니다. 먼저 시리얼 희석을 수행 합니다 접시를 준비 합니다.
각 희석 플레이트에 90 마이크로리터의 실험 용 미디어를 추가합니다. 다음으로 세포를 준비합니다. 96웰 플레이트에서 호일을 제거하여 한 우물의 물방울이 다른 접시에 들어가지 않도록 매우 주의하십시오.
효모는 원심분리로 인해 플레이트 바닥에 집중될 것이다. 희석 중에 세포가 잘 혼합되도록 하려면 항상 더 큰 양의 미디어에 소량의 세포를 추가합니다. 그런 다음 혼합물에 또 다른 대량의 미디어를 추가합니다.
모든 단계에서 적극적으로 파이펫 혼합해야합니다. 이 비디오에서는, 우리는 포화 및 합성 완전 매체에서 효모 세포에 대한 희석제를 수행, 우리는 현미경 플레이트에서 잘 당 약 4, 000 세포의 최종 농도를 달성하기 위해 10, 000 배를 희석할 것이다. 세포를 다시 일시 중단하려면 파이펫을 위아래로 힘차게 내리고 파이펫 끝을 원형 운동으로 우물 주위로 이동합니다.
혼합 후, 잘 A1에서 여기에서 볼뿐만 아니라 어떤에 남아있는 정착 효모의 흔적이 없어야한다. 여기에 표시된 다른 모든 우물은 비교를 위해 다시 중단되지 않았습니다. 예를 들어, 전작된 플레이트의 세포를 혈전계와 함께 계산하고 동일한 비율로 동일한 우물에 추가할 다른 균주와 결합합니다. 여기서, 우리는 1 대 1 비율로 형광 기준 변형과 우리의 미리 성장한 접시에서 세포를 혼합합니다.
세포 농도가 표준화되면 10 마이크로리터의 셀을 첫 번째 시리얼 희석 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 100 마이크로리터의 미디어를 200 마이크로리터의 최종 볼륨에 추가합니다. 세포와 미디어를 모두 추가하면 파이펫이 격렬하게 섞여 파이프 끝을 우물 주위로 원형 모션으로 이동시합니다.
이 시점부터 세포가 현미경 플레이트에 추가될 때까지 프로토콜을 통해 신속하게 진행됩니다. 다음으로, 제1 직렬 희석 플레이트에서 효모 10마이크로리터를 제2 직렬 희석 플레이트에 넣습니다. 그런 다음 실험 매체의 마이크로리터 100을 추가합니다.
잘 섞으세요. 효모가 flocculate하는 경향이없는 경우, 그들은바로이 단계 후 현미경 플레이트에 추가 할 준비가되어 있습니다. 도금으로 즉시 진행하십시오.
그러나, 사용하는 효모 균주가 적당한 경향을 갖는 경우, 다음과 같은 선택적 초음파 처리 단계가 필요합니다. 초음파 처리하면 첫 번째 파이펫이 초음파 처리 전에 효모 용액을 다시 한 번 혼합합니다. 희석 된 효모를 초음파 처리기에 놓고 96 웰 핀을 각 우물의 용액에 담그지만 우물바닥을 만지지 않습니다.
소닉 프로그램을 설정, 이는 충분히 강한 떨어져 flocculated 효모 세포를 분해하지만, 세포를 죽이거나 높은 스트레스 반응을 일으키지 않습니다. 일부 테스트는 주어진 실험에 가장 적합한 초음파 처리 프로그램을 식별하기 위해 필요할 수 있습니다. 프로그램이 완료되면 셀을 제거하고 즉시 다음 단계로 진행합니다.
두 번째 시리얼 희석 플레이트에서 효모 15 마이크로리터를 현미경 플레이트에 넣습니다. 파이펫은 위아래로 섞어 주지만, 플레이트 의 우물 바닥에 부착 된 Concanavalin A를 방해하지 않도록 주의 깊게하십시오. 다음으로, 현미경 플레이트에 400 마이크로리터의 최종 부피에 200 마이크로리터의 실험 매체를 추가합니다.
파이펫은 조심스럽게 섞입니다. 통기성 멤브레인으로 접시를 덮습니다. 플레이트의 가장자리가 잘 밀봉되어 있는지 확인합니다.
효모 세포가 플레이트 의 하단에 있는 Concanavalin A에 부착하기 위하여 411 시간 G에서 2 분 동안 보풀 및 정전기 자유로운 조직으로 현미경 플레이트를 원심분리합니다. 이제 플레이트를 이미지화할 준비가 되었습니다. 현미경에서 보풀과 정적 프리 와이프로 플레이트의 상단과 바닥을 닦고 압축 공기를 플레이트 바닥에 날려 이물질을 제거합니다.
접시를 현미경에 놓습니다. A1이 왼쪽 상단 모서리에 있고 현미경이 세포 성장을 위한 올바른 온도로 가열되어 있는지 확인하십시오. 또한 플레이트가 현미경으로 깔끔하게 고정되어 있고 플레이트의 바닥이 평평하다는 것을 확인하십시오.
접시에 플라스틱 덮개가 있는 경우 현미경 검사를 시작하기 전에 이를 제거하십시오. 다운스트림 분석을 위해 좋은 이미지를 캡처하는 것이 중요합니다. X 및 Y 좌표와 초점 위치로 자동으로 생성된 파일을 로드하여 전체 현미경 플레이트를 이미지화합니다.
미리 생성된 파일을 사용하는 경우, 스팟은 현미경 플레이트의 몇 가지 위치를 확인하여 세포가 올바른 초점 평면에 있는지 확인합니다. 초점이 있는 평면이 세포 위에 약간 상주하여 어두운 테두리로 둘러싸여 배경보다 밝습니다. 실험에 사용할 시간점 수와 시간 포인트 간격을 설정합니다.
성장률과 형광 강도 데이터를 모두 수집하는 경우 형광 이미징 프로그램도 설정합니다. 현미경 플레이트의 위치가 과다 노출되지 않도록 모든 채널의 밝기를 이미지화합니다. 라이브 모드에 없을 때 사용할 노출을 테스트합니다.
형광 이미지의 경우 형광이 육안으로 볼 수 있어야합니다. 그러나 그렇지 않으면 낮은 노출 값을 설정하는 것이 좋습니다. 개별 세포에 의해 시드된 적절히 간격이 있는 식민지는 플레이트 표면을 따라 단층에서 자랍니다.
그 결과, 자동화된 이미지 분석을 사용하여 많은 개별 마이크로콜로니의 성장률을 정확하게 계산할 수 있습니다. 형광 마커는 동일한 우물에서 성장하는 여러 균주를 분화하는 데 사용할 수 있습니다. 그 결과 공유 환경에서 성장하는 개별 마이크로콜로니에 대한 성장률의 전체 분포를 계산할 수 있습니다.
이 실험으로 달성 가능한 큰 샘플 크기는 또한 다른 긴장 또는 성장 조건 사이의 평균 차이의 정확한 추정을 허용합니다. 여기서, 돌연변이 축적 선 및 잘 GFP 기준 대조군 콜로니세트에서 단일 우물에서 자란 식민지의 쌍 집합에 대한 성장속도가 표시됩니다. 세포가 현미경 판에 응집하는 것을 관찰하는 경우에, 덩어리는 도금하기 전에 초음파 처리에 의해 분해되어야 합니다.
분해되지 않은 덩어리의 세포는 플레이트 표면을 따라 평면 마이크로 콜로니에서 자라지 않아 성장률을 올바르게 계산할 수 없습니다. 모든 미디어가 미세 식민지 성장 속도 분석과 호환되는 것은 아닙니다. 효모 추출물을 포함하거나 pH가 낮은 매체를 포함한 일부 형태의 매체는 Concanavalin A.이 실험 및 잘못된 성장 속도 측정을 통해 성장하는 마이크로 콜로니에서 멀리 떠있는 세포의 결과, Concanavalin A.이 세포의 결합을 방지합니다.
너무 조밀하게 세포를 도금하지 않는 것이 중요합니다. 세포가 너무 밀접하게 도금되면, 빠르게 성장하는 마이크로 콜로니는 색상 추적의 손실로 여기에 표시된 이전 시점에서 병합됩니다. 이 효과는 느린 성장 식민지가 충분한 시간 지점에서 데이터를 수집하기 전에 이웃과 병합 할 가능성이 적기 때문에 성장 속도 예측을 편향 시킬 수 있습니다.
성장 조건에 따라, 세포의 하위 집합 성장 하기 시작 하기 전에 지연 단계를 겪을 수 있습니다. 콜로니 지역을 사용하여 성장 곡선을 사용 가능한 모든 시간 점에 맞추기보다는 성장률을 계산할 때 이를 설명하는 것이 중요합니다. 설명된 프로토콜은 효모 성장 및 진화와 관련된 광범위한 질문을 조사하는 데 사용될 수 있다.
그것의 유연한 마이크로 플레이트 형식은 다른 효모 종, 다른 성장 조건, 그밖 세균 및 배양에 있는 잠재적으로 그밖 세포에 적응될 수 있다는 것을 의미합니다.
