Il nostro protocollo per l'elevata produttività, le cellule di lievito consentono il monitoraggio della crescita e dell'espressione genica per migliaia di microcoloni contemporaneamente. È possibile quantificare la differenza tra ceppi, tra ambienti e persino tra cellule geneticamente identiche coltivate in un ambiente condiviso. Il protocollo fornisce stime precise del tasso di crescita medio e dell'intensità media di fluorescenza dei giornalisti dell'espressione genica.
Inoltre, poiché vengono saggiate così tante microcolonie individuali, si ottengono stime precise di intere distribuzioni di valori di crescita ed espressione. Questo protocollo segue due fasi principali, la preparazione della piastra sperimentale e la preparazione delle cellule per l'imaging. Le cellule devono essere placcate immediatamente dopo la diluizione e la miscelazione.
Quindi ti consigliamo di impostare prima la tua piastra sperimentale. Noterai la miscelazione ripetuta delle celle in questo protocollo, che è estremamente importante nei passaggi fino alla placcatura. Il giorno dell'esperimento, tutti i supporti e le altre soluzioni utilizzate per il test devono essere filtrati con un filtro a due micron, anche se sono già sterili, al fine di rimuovere eventuali cristalli che possono apparire nelle immagini al microscopio.
Ciò include i supporti sperimentali e la soluzione Concanavalin A. Quindi, preparare la piastra del microscopio. Al fine di mantenere la superficie in vetro dei pozzi libera da detriti e graffi, tenere sempre una lanugine e una salvietta libera statica sotto la piastra.
Utilizzare una tecnica sterile su una panca sterilizzata. Filtrare 25 millilitri di soluzione 1X Concanavalin A e pipettare 200 microlitri in ogni pozzo della piastra del microscopio. Si consiglia di stabilizzare la pipetta per garantire la corretta altezza.
Centrifugare la piastra del microscopio con una pelucchia e una salvietta libera statica sotto di essa per due minuti a 411 volte G al fine di rimuovere eventuali bolle d'aria che potrebbero impedire a Concanavalin A di rivestire uniformemente il fondo dei pozzi. Lasciare riposare la piastra contenente la soluzione Concanavalin A per una o due ore. Sii coerente nei tuoi esperimenti.
Dopo l'incubazione Concanavalin A, cancellare la Concanavalin A dalla piastra del pozzo 96 con un dispositivo di aspirazione o scaricando con forza la soluzione dalla piastra come mostrato qui. Alcune goccioline rimarranno. Quindi, lavare i pozzi aggiungendo 400 microlitri di acqua sterile ad ogni pozzo.
Aggiungere l'acqua immediatamente dopo aver rimosso la soluzione Concanavalin A. Non lasciare asciugare il piatto. È importante evitare di toccare il fondo rivestito della piastra con le punte della pipetta per non spostare o rimuovere la concanavalina A dalla superficie di vetro dei pozzi.
Rimuovere l'acqua allo stesso modo della soluzione Concanavalin A e aggiungere immediatamente 185 microlitri di mezzi sperimentali alla piastra del microscopio. Non lasciare che la piastra si sieda asciutta. La piastra è ora pronta per l'aggiunta di 50 microlitri di cellule diluite.
Recupera la tua piastra randomizzata da 96 po', pre-cresciuta. La domanda sperimentale determinerà se le cellule sono sature o in fase di log e il numero di repliche randomizzate che devono essere utilizzate nel saggio. Centrifugare la piastra per due minuti a 411 volte G per ridurre al minimo la possibilità di contaminazione incrociata quando si rimuove il rivestimento del foglio.
Assicurati di non inclinare mai la piastra quando la stai gestendo. Se lievito e mezzi entrano in contatto con il foglio che copre la piastra, ci può essere contaminazione tra i pozzi. Per prima cosa prepara le piastre in cui condurrai le tue diluizioni seriali.
Aggiungere 90 microlitri di supporti sperimentali a ciascuna delle piastre di diluizione. Quindi prepara le tue cellule. Prestare estrema attenzione quando si rimuove il foglio dalla piastra da 96 pozzi per evitare che le goccioline da un pozzo entrino in un altro.
Il lievito sarà concentrato nella parte inferiore della piastra a causa della centrifugazione. Per assicurarsi che le celle siano ben mescolate durante la diluizione, aggiungere sempre un piccolo volume di celle a un volume maggiore di supporti. Quindi aggiungere un altro grande volume di media alla miscela.
Assicurati di pipettare vigorosamente ad ogni passo. In questo video, abbiamo eseguito diluizioni per cellule di lievito a saturazione e mezzi completi sintetici, che diluiremo 10.000 volte per raggiungere una concentrazione finale di circa 4.000 cellule per pozzo nella piastra del microscopio. Per sospendere di nuovo le celle, pipettare vigorosamente su e giù e spostare la punta della pipetta intorno al pozzo con un movimento circolare.
Dopo la miscelazione, non dovrebbero rimanere tracce di lievito stabilizzato come visto qui nel pozzo A1. Tutti gli altri pozzi qui mostrati non sono stati sospesi per il confronto. Contare le cellule nella piastra pre-coltivata, ad esempio, con l'emocitometro e combinarle con qualsiasi altro ceppo che si aggiungerà allo stesso pozzo in proporzioni uguali. Qui, mescoliamo le cellule della nostra piastra pre-coltivata con un ceppo di riferimento fluorescente ad un rapporto uno a uno.
Una volta standardizzate le concentrazioni cellulari, aggiungere dieci microlitri di cellule alla prima piastra di diluizione seriale. Quindi aggiungere 100 microlitri di supporti a un volume finale di 200 microlitri. Con l'aggiunta di cellule e mezzi allo stesso modo, pipetta mescolare vigorosamente, spostando la punta della pipetta intorno ai pozzi in un movimento circolare.
Da questo punto in poi, fino a quando le celle non vengono aggiunte alla piastra del microscopio, procedere rapidamente attraverso il protocollo. Successivamente, aggiungere dieci microlitri di lievito dalla prima piastra di diluizione seriale nella seconda piastra di diluizione seriale. Quindi aggiungere 100 microlitri di mezzi sperimentali a questo.
Mescolare bene. Se il lievito non ha la tendenza a floccularsi, allora sono pronti per essere aggiunti alla piastra del microscopio direttamente dopo questo passaggio. Procedere immediatamente alla placcatura.
Tuttavia, se i ceppi di lievito che stai usando hanno una moderata tendenza al flocculato, sarà necessario il seguente passaggio di sonicazione opzionale. Se sonicante, la prima pipetta mescola ancora una volta la soluzione di lievito, prima della sonicazione. Posizionare il lievito diluito sul sonicatore e immergere i perni da 96 pozzi nella soluzione di ogni pozzo, ma non toccare il fondo del pozzo.
Impostare il programma di sonicazione, che è sufficientemente forte da rompere le cellule di lievito flocculate, ma non uccide le cellule o causa risposte di stress elevate. Alcuni test potrebbero essere necessari per identificare il miglior programma di sonicazione per un dato esperimento. Una volta completato il programma, rimuovere le celle e procedere immediatamente al passaggio successivo.
Aggiungere 15 microlitri di lievito dalla seconda piastra di diluizione seriale nella piastra del microscopio. Pipetta su e giù per mescolare, ma farlo con attenzione per evitare di disturbare la Concanavalin A attaccata al fondo dei pozzali della piastra. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di mezzi sperimentali a un volume finale di 400 microlitri, alla piastra del microscopio.
Pipettare mescolare con cautela. Coprire la piastra con una membrana traspirante. Assicurarsi che i bordi della piastra siano ben sigillati.
Centrifugare la piastra del microscopio con una lanugine e un tessuto libero statico sotto di essa per due minuti a 411 volte G affinché le cellule di lievito si attaccano alla Concanavalin A nella parte inferiore della piastra. Il piatto è ora pronto per essere immaginato. Al microscopio, pulire la parte superiore e inferiore della piastra con una pelucchi e una salvietta libera statica e soffiare aria compressa sul fondo della piastra per rimuovere i detriti.
Posizionare la piastra sul microscopio. Assicurarsi che il pozzo A1 si trova nell'angolo in alto a sinistra e che il microscopio sia riscaldato alla temperatura corretta per la crescita cellulare. Assicurati anche che la piastra sia ordinatamente infilata nel microscopio e che il fondo della piastra sia piatto.
Se la piastra ha un coperchio di plastica, rimuoverlo prima di iniziare la microscopia. Questo sarà importante per catturare buone immagini per l'analisi a valle. Carichiamo un file generato automaticamente con le coordinate X e Y e le posizioni focali per l'immagine dell'intera piastra del microscopio.
Se si utilizza un file pregenerato, selezionare alcune posizioni nella piastra del microscopio per assicurarsi che le celle si trovano nel piano focale corretto. È utile che il piano focale sia leggermente sopra le celle in modo che siano circondate da un bordo scuro e siano più luminose dello sfondo. Impostare il numero di punti di tempo e la spaziatura dei punti di tempo che verranno utilizzati per l'esperimento.
Se si raccolgono sia i dati relativi al tasso di crescita che all'intensità della fluorescenza, impostare anche un programma di imaging a fluorescenza. Regolare la luminosità in ogni canale da imageare in modo che nessuna posizione sulla piastra del microscopio sia sovraesposta. Testa l'esposizione che utilizzerai quando non sei in modalità live.
Per le immagini fluorescenti, la fluorescenza dovrebbe essere visibile ad occhio nudo. Ma per il resto si consiglia di impostare valori di esposizione bassi. Colonie opportunamente distanziate seminate da singole cellule crescono in un monostrato lungo la superficie della piastra.
Di conseguenza, l'analisi automatizzata delle immagini può essere utilizzata per calcolare con precisione il tasso di crescita per molte singole microcolonie. I marcatori fluorescenti possono essere utilizzati per differenziare più ceppi che crescono nello stesso pozzo. Di conseguenza, è possibile calcolare intere distribuzioni dei tassi di crescita per le singole microcolonie che crescono in un ambiente condiviso.
Le grandi dimensioni del campione ottenibili con questo esperimento consentono anche una stima precisa delle differenze medie tra ceppi diversi o condizioni di crescita. Qui, vengono mostrati i tassi di crescita per insiemi accoppiati di colonie coltivate in singoli pozzi da una serie di linee di accumulo di mutazioni e le colonie di controllo di riferimento GFP in-well. Se si osservano cellule che si raggruppano sulla piastra del microscopio, i grumi devono essere spezzati per sonicazione prima della placcatura.
Le cellule in grumi che non vengono scomposte non cresceranno in una microcolonia planare lungo la superficie della piastra, rendendo impossibile un corretto calcolo del tasso di crescita. Non tutti i supporti sono compatibili con il saggio sul tasso di crescita dei microcolony. Alcune forme di mezzi, compresi i mezzi che contengono estratto di lievito o hanno un basso pH, impediscono il legame delle cellule alla Concanavalina A.Ciò si traduce in cellule che galleggiano lontano dalla crescita di microcoloni nel corso dell'esperimento e misurazioni errate del tasso di crescita.
È importante evitare di placcare le cellule troppo densamente. Quando le celle sono placcate troppo da vicino, le microcolonie a crescita più rapida si fondono nei punti di tempo precedenti, mostrate qui come una perdita di tracciamento del colore. Questo effetto può biasimiare le stime del tasso di crescita poiché le colonie a crescita lenta hanno meno probabilità di fondersi con i loro vicini prima che vengano raccolti dati da punti di tempo sufficienti.
A seconda delle condizioni di crescita, un sottoinsieme di cellule può subire una fase di ritardo prima di iniziare a crescere. È importante tenere conto di questo quando si utilizzano aree di colonia per calcolare il tasso di crescita piuttosto che adattare una curva di crescita a tutti i punti di tempo disponibili. Il protocollo descritto può essere utilizzato per indagare una vasta gamma di domande relative alla crescita e all'evoluzione del lievito.
Il suo formato di micropiatta flessibile significa che può essere adattato ad altre specie di lievito, diverse condizioni di crescita, altri microbi e potenzialmente altre cellule in coltura.
