We thank Eliq Oster for the images of the Bacillus subtillis. The work is supported by the European Research Council (# 260871) and the Israel Science Foundation (#592/10).

1. 설치 빌드 <ol><li> 광학 해상도와 평판 스캐너 선택 : 4,800 dpi로를; 하드웨어 해상도 : 4,800 X 9,600 dpi로; 색상 비트 심도 : 48 비트, 관련 온도와 습도 수준에서 작동 할 수 있습니다. </li><li> 페트리 접시는 일반적으로 상업 스캐너에 사용되는 용지는 달리 상당한 양이있다. 식민지는 약 5 ㎜ 스캐너 표면 위에, 한천 층의 상단에 거짓말. 주 : 대부분의 스캐너에 대한 식민지의 초점이 될 것입니다. </li><li> 일부 스캐너 회사 같은 컴퓨터 동일한 분류 스캐너의 하나 이상의 인스턴스의 연결을 허용하지 않는다. 하나 이상의 스캐너가 부착 고유하게 식별 할 수 있는지 확인합니다. </li><li> 아래에 자세히 설명 등의 소품​​을 준비한다 : <ol><li> 멸균 블랙의 준비 조각 플레이트를 커버하는 천 (그림 1 단계 2)를 느꼈다. </li><li> 장소에 페트리 접시를 개최, 스캐너에 맞게 하얀 접시 홀더 (재료 및 방법)를 준비하고 6 HOL을 가지고에스 접시의 크기 (그림 1 단계 3). </li></ol></li><li> 미생물의 성장을 위해 필요하다면, 온도 제어 된 환경에서 스캐너를 탑재. 컴퓨터에 스캐너를 연결합니다. </li><li> 선택 사항 : 컴퓨터에 릴레이를 연결하고 온도 변화를 극복하기 위해 스캐너의 온 / 오프 스위치를 우회. 참고 : 릴레이 유닛은 매우 온도에 민감한 미생물입니다. 전자가 고르지 표면을 가열하지 않도록 그것은 스캐너를 꺼집니다. 스캐너 표면의 일부만을 사용하여 유사한 결과를 얻을 수있다. </li></ol> 2. 스캔 관리자에게 설치 <ol><li> http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.html에서 지정된 디렉토리에 모두 &#39;검색 관리자&#39;응용 프로그램 파일을 복사합니다. </li><li> 그들은 컴퓨터 관리 -&gt; 장치 관리자 -&gt; 이미징 장치 (에 나타나는 스캐너의 이름에 따라 ScanningManager.exe.config 파일을 구성 <stroNG&gt; 그림 2). </li><li> &#39;스캔 관리자&#39;응용 프로그램의 문제 해결을 위해 내가 읽어보기 파일을 참조하십시오. </li><li> &#39;스캔 관리자&#39;응용 프로그램에 대한 자세한 설명서는 Documentation.html를 참조하십시오. </li></ol> 3. 실험을 수행 <ol><li> 페트리 접시 (그림 1)를 준비 : <ol><li> 약 2,000 CFU / ml의 문화를 희석. 균일 플레이트 표면에 문화의 0.1 ML 플레이트. </li><li> 식민지와 요리 사이 좋은 대조를 얻기 위해 수분을 흡수, 살균 블랙의 조각으로 접시를 커버 천 느꼈다. 접시에 뚜껑을 넣어. </li></ol></li><li> 스캐너의 홀더에 접시를 놓습니다. </li><li> 첨부 된 스캐너 목록에서 참여 스캐너를 선택 : 스캔 관리자 (그림 3)를 시작합니다. (회 반복)를 촬영하는 이미지의 수, 연속적인 이미지 사이의 시간 간격 (시간 간격), 및 t를 시작하기 전에 시간 지연을 선택그는 (후 시작) 실험. </li></ol> 이미지의 4. 분석 참고 : 계산 방법의 개요는 http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications에서 비상업적 인 용도 무료로 사용할 수있다 &quot;ScanLag&quot;를 사용하여 MATLAB에서 이미지 분석을 위해 제공됩니다. HTML. 사용 가능한 추가 기능은 소프트웨어 매뉴얼에 설명되고, 예를 들어 코드는 보충된다. <ol><li> 별도의 폴더에 각 스캐너에서 이미지를 정렬합니다. </li><li> 매트랩 명령 창을 사용하여, 다음 절차를 실행. 이 절차를 실행하는 데 필요한 매개 변수는 소프트웨어 설명서에 정의되어 있습니다. <ol><li> 전처리를 수행 할 수 PreparePictures을 실행하여 사전에 스캐너에서 이미지가 정렬됩니다. 각 페트리 접시는 이미지의 각 시퀀스에서 잘립니다. 각각의 이미지가 수집 된 시간은 타임 스탬프에서 검색됩니다. </li><li> 전자에서는 탐지 및 추적을 수행 할 수있는 실행 TLAllPlatesACH 페트리 접시는 별도로, 식민지가 감지 및 식별 번호가 할당됩니다. </li><li> 추출 된 데이터의 분석 : 각 검출 된 콜로니의 크기는 시간의 함수로서 측정된다. 식민지의 모양 분포를 추출하려면 매트랩 명령 창에서 다음과 같은 기능을 (자세한 내용은 소프트웨어 설명서에서 사용할 수 있습니다)를 사용합니다 : <ol><li> 시간 (그림 4)에 비해 크기를 식민지의 그래프와 함께 특정 페트리 접시의 분석을 표시 ScanLagApp를 실행합니다. <ol><li> 판의 현재 시간을 변경하려면 슬라이더를 사용합니다. 타이밍도 콜로니 영역 그래프 매칭 수직선으로 표시 될 것이다. </li><li> 관련 곡선을 확인하기 위해 식민지를 클릭하고, 그 반대의 경우도 마찬가지, 관련 식민지를 찾기 위해 곡선을 클릭합니다. 식민지를 식별 한 후, 표현형은 확인 된 배양 접시에서 식민지를 선택하여 검색 할 수 있습니다. </li><li> 추에 의해 자동 분석 필터 결함식민지를 노래하고 제외 버튼을 클릭. 식민지의 수를 제외하면 클릭하면 노란색으로 바뀝니다. </li></ol></li><li> 각 플레이트의 분석 결과를 거쳐, 그 결과를 정리해 보면 : <ol><li> 등장 시간의 히스토그램을 만들 AddHistograms를 실행합니다. </li><li> 분포의 생존 곡선 표현을 만들 수 plotDeathCurve를 실행합니다. </li><li> 실험의 모든 식민지의 모양 시간을 얻을 수 GetAppearanceTimes를 실행합니다. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence:+mechanisms+for+triggering+and+enhancing+phenotypic+variability.">Persistence: mechanisms for triggering and enhancing phenotypic variability.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 21, 768-775 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

직접 관찰에 기초하여 현미경 방법은 종종 단일 셀 동작을 연구하기위한 &quot;황금 표준&quot;으로 간주된다. 세균 집단에서 지연 시간의 분포의 측정을 가능 ScanLag는, 단일 세포 분석에서 얻은 분포와 잘 일치에 데이터를 제공하고, 더 높은 통계를 달성한다. 몇 가지 중요한 단계가 제대로 작동하려면이 방법을 수행 할 수있다 : 첫째, 좋은 이미지를 얻기 위해 4,800 X 9,600해야 스캐너 해상도에 타협하지 않습니다. 둘째, 전원 관리 모듈 (단계 1.6)하지 않고, 온도 구배는 평판면에 발전 및 성장에 영향을 미칠 수가있다. 또 다른 중요한 단계는 실수로 소프트웨어에 의해 식민지로 간주되었을 수 있습니다 먼지와 같은 결함의 여과이다. 소프트웨어의 기본 배경 공제는 일반적으로 이러한 결함을 극복하지만, 때로는 &quot;false&quot;로 식민지에이수동으로 필터링 할 수. () 미생물의 성장 속도는 온도에 의해 영향을받습니다 주요 문제 해결 단계 여러 가지 이유로, 설치에 간 플레이트의 변화를 처리 할 수​​ 있습니다. 다른 온도와 습도 조건으로 인해 인큐베이터에있는 접시의 고르지 환기 또는 위치에 발생할 수 있습니다. (b)는 스캐너의 전자는 스캐너의 표면에 걸쳐 온도 구배를 가열하고 발생할 수있다. 10 함께 전에 스캐너 표면 온도의 측정과, 바실러스 균에 공간적 열 구배의 영향을 도시도 전원 관리 모듈을 구현 한 후 (1.6 단계). 이 모듈이 새로운 스캐너 필요하지 않을 수도 있으며 스캐너 표면의 일부만이 사용되는 경우, 전원 관리가 불필요 할 수 있다는 것을주의한다. (C) 한천 영양의 다른 불투명도 플레이트가 검출 다른 수준으로 이어질 수 있습니다.도 11 일 그림다른 혼탁이 발생할 한천의 다양한 볼륨의 전자 허용. 실험적으로 ScanLag 기술을 수행하기 쉽고, 단지 표준 배양 접시에 미생물을 도금하고, 스캐너의 표면에 배치해야합니다. 개발 된 소프트웨어는 전체 절차를 제어합니다. 이미지 수집을 자동으로 수행하고, 식민지 추적을위한 이미지 분석은 자동입니다. 또한, 시스템은 스케일 업 할 수있다 동시에 여러 조건을 측정하기 위해. 마지막으로,이 방법은 상업 사무실 스캐너에 의존하고, 따라서 낮은 비용입니다. 이 기법은 E. 다를 미생물의 연구로 확장 될 수있다 콜라이 K-12 그러나 몇몇 고려하여야한다. 먼저, 나중에 것들에 이른 나타나는 콜로니의 영향은 이전 간행물 7에 상세히 설명한 바와 같이, 평가되어야한다. E.에 대한 콜라이 K-12,접시 당 CFU의 최대 밀도는. 식민지의 서로 다른 크기와 다른 변종 (200), 그리고 식민지 사이의 다른 가능한 크로스 토크는 다른 농도가 필요할 수 있습니다. 둘째, 판의 분석은 고체 배지와 식민지 사이의 대비에 따라 수정해야 할 수도 있습니다 특정 소프트웨어 기반 임계 값을 보정한다. 이 소프트웨어는 지연과 성장 속도를 넘어, 다른 식민지의 특성을 추출도 확장 할 수 있습니다. 소프트웨어 코드는 열려 있고 식민지 모양, 밝기, 부드러움과 색상을 추출하기 위해 수정 될 수 있습니다. 측정은 단일 세포에서 유래 콜로니에 만들어져 있기 때문에, 데이터는 인구 레벨 측정에 의해 측정 될 수없는 새로운 표현형을 드러낸다. 지연 시간 분포의 중요성은 항생제의 존재 드러난다. 대부분의 항생제는 성장 세포에 대한 효과적인 것으로 알려져있다; 따라서 한 셀은 유도기에 남아 성장하지 않기 때문에, 그들은 프로 아르그 항생제 (21)의 영향에서 만약 보호. 생존 박테리아의 숫자는 항생제 치료 15,22,23 동안 시간 간격으로 평가 될 때, 영속라는 박테리아의 모집단은 종종 밝혀진다. 경우에 따라 항생제 치료에 내성이 장기간 지연에서 유래. 이 설정을 사용하여,이 지연은 밝혀 종종 적지 않은 분포 (24) (그림 6)이있다. 이 방법은 드문 돌연변이를 검색 할 수 있습니다. 예를 들어, 돌연변이 된 인구 도금 후, 돌연변이 표현형에 기초하여 식별 될 수 있고, 선택하지 않고, 직접 절연. 설치 또한 인근 식민지의 밀도의 함수로 식민지의 성장을 측정하여 세포 - 세포 상호 작용을 모니터 할 수 있고 이러한 쿼럼 센싱 또는 집단 박테리아의 확산 등의 현상을 정량화 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 미래의 실험에 의해 밝혀 다차원 정보는 미생물 인구의 더 나은 특성으로 이어질 것의 의료 및 환경 연구의 발전에.

박테리아는 많은 스트레스 상황에 반응하도록 진화했다. 스트레스에 대한 적응의 일반적인 특징은 성장 역학 1,2의 변화입니다. 기하 급수적 인 성장 속도와 지연 시간, 새로운 조건에 적응하는 데 필요한, ​​즉 시간 : 성장 역학은 두 개의 매개 변수에 의해 주로 특징이다. 높은 처리량 방법 중 다수가 성장 속도를 측정하는 반면에 초점이 새로운 조건에 적응 특성에 대한 결정적인 매개 변수되지만, 지연 시간은, 종종 간과되는 파라미터이다. 변화하는 상황에 적응 정량은 전통적으로 시간이 많이 드는 방법에게 3,4를 사용하여 수행되었습니다. 최근에는 첨단 기술은 단일 세포 5,6의 분석을 위해 개발되었다. 그러나, 성장 지연 느린 성장 (즉, 지연 시간) 2,3 다음 정상적인 성장을 구별하는 것은 여전히 어렵다. 자동화 된 방법으로, ScanLag 7, 건설되었다이 두 개의 유사한 표현형을 구별. 지연 시간 분포에 대한 연구의 중요성에 눈에 띄는 예는 항생제 치료에서 드러났습니다. 항생제와 다른 스트레스 많은은 적극적으로 성장하는 세포를 죽일하고, 따라서 &quot;후행&quot;하는 세포는 8 보호를받습니다. 지연 시간을 모니터링하기 위해, 하나는 현미경 단일 세포를 관찰하고 첫번째 부분에 시간을 모니터링 할 수있다. 이 방법의 가장 큰 단점은 동적 시간 범위가 제한되어 있다는 것입니다; 초기 성장하고 그 세포 효과적으로 긴 지연 시간에 따라 세포의 성장을 감소 지수 레이트로 표면을 커버. 유동 챔버의 사용이 다소 5를 우회하지만 세포의 제한된 수를 추적 할 수 있고 인구의 대부분이 성장 시작된 후에 유도기를 종료 세균 분획이 관찰 될 수 없다. 이러한 제한에도 불구하고, 몇몇 연구 디의 레벨의 영향을 평가 한fferent는 하나의 세포 현미경 9-12를 사용하여 지연 시간의 분포를 강조한다. 지연 시간 분포를 모니터링하는 다른 방법은 탁도 측정 13,14 통해서이다. 각각 하나의 세포에서 시작 많은 병렬 문화는,, 시간이 지남에 따라 문화에 박테리아의 수를 측정하는 광학 밀도 리더에서 재배된다. 이 방법은 추정의 정밀도에 의해 접시에 우물의 수에 제한됩니다. 자동화 된 방법도 매우 긴 지연 시간이 인구에있는 박테리아의 작은 비율에 대해 평가하는 지연 시간과 성장의 시간 분포를 가능하게하는, ScanLag라는 개발되었다. 이 방법은 기존의 영양 한천 플레이트 (15) (그림 1)에 식민지의 검출을 기반으로합니다. 검출 (16, 17)에게 주기적으로 접시의 이미지를 얻기 집 소프트웨어에서이 지정하는 상업 스캐너 (18)의 배열을 자동화하기 위해 설계되었다. 소프트웨어였다자동으로 이미지를 분석하고 시간이 80 픽셀로 20 픽셀에서 성장을 여기에 정의 된 각 식민지의 각 식민지와 성장의 시간 외관의 시간을 정량적 매개 변수 (19, 20)를 추출 할 수 있도록 설계. 여기에서 우리는 시스템의 설치 및 향상된 사용자 인터페이스를 개선 한 내용 자동화 이미지 분석 소프트웨어의 사용을 포함하여, 상세하게 방법을 제시한다. 이 방법은 같은 형태와 같은 색 콜로니 다른 특성을 측정하도록 적응 될 수있다. 이러한 유형의 매개 변수 측정은 다차원 phenomics의 시스템의 사용을 허용합니다. 방법은 하나의 세포에서 식민지를 감지하면, 시스템은 인구 수준의 측정에 의해 측정 할 수있는 새로운 표현형을 표시 할 수 있습니다. 기술은 희소 변형 검출 및 검색을 가능하게하고, 원하는 특성에 대해 스크리닝을 용이하게한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Material</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacto Agar</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Difco LB broth</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish 90mm</td>
			<td style="width:71px;">Miniplast</td>
			<td style="width:119px;">20090-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Epson Perfection v37</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B207201</td>
			<td style="width:167px;">Flatbed Scanner with Optical resolution: 4800 dpi, Hardware Resolution:&#160;4800 x 9600 dpi, color bit depth 48-bit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epson Perfection v200</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B188011</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epson Perfection 3490</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B177011</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ADU200 USB Relay</td>
			<td style="width:71px;">ONTRAK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">pieces of sterile black felt cloth</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>approximatly 100 x100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">white plate holders</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>surface size, with 6 x 99mm diameter hole</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Delerin rings the size of the Petri dish</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">inner diameter: 72 mm 
			outer diameter: 86 mm 
			top outer diameter: 90 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scanlag: high-throughput quantification of colony growth and lag time

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.

지연 시간 분포 추출의 예로서,도 5는 스크리닝 검사에서 수행되는 바와 같이, 시간이 지남에 따라 하나의 플레이트에 대한 특정 특성을 가진 각각의 콜로니를 식별하고 추적하기 ScanLag의 능력을 나타낸다. 미생물의 문화가 이질적인 경우, 다른 부분 집단은 분석 기간 동안 스스로를 발견 할 수 있다는 것입니다. 예를 들어, 그림 6은 모양 정량을 표시하고, 따라서 E.의 돌연변이 균주에서 바이 모달 지연 시간 분포를 보여 대장균. 세포의 성장 속도는 콜로니의 등장 시간에 영향을 미친다. 식민지가 같은 속도로 성장하면, 후반 외관은 지연 시간 (그림 7)에 기인 할 수있다. 방법은 실제로 단셀의 지연 시간을 측정하는 것을 확인하기 위해, 우리는 단일 셀 현미경을 사용하여 수득 된 것과 ScanLag 결과를 비교; 이 유효성 검사는 DESC입니다이전의 간행물 7에 상세히 ribed. 이 방법은 현미경으로 평가 될 수있는 것보다 더 많은 셀을 모니터링 할 수 있습니다. 현미경을 사용하고 ScanLag를 사용하여 얻은 얻어진 분포가 크게 중복. ScanLag 분포는 약간 넓다; 이론적 분석은 분할 시간의 표준 편차의 순서로 넓혀 예측. 성장 시간은 각 균주에 대해 서로 다른 경우에, 외형의 지연의 기원은 더 다른 방법을 사용하여 조사한다. 이후 식민지의 모양에 초기 나타나는 식민지의 영향을 조사 하였다. 제어 실험 7 나중에 외관은 한 접시 당 콜로니의 총 수 (그림 8) (200)를 초과하지 않았다으로 영향을받지 않는 것을 확인했다. 또 다른 제어 실험 접시에 식민지의 위치가 그 모습 시간 7에 영향을 미치는되지 않았 음을 확인했다. P의 분석LATES은 성장 매체 또는 미생물의 종류에 존재하는 영양소에 따라 수정해야 할 수도 있습니다 특정 임계 값을 보정한다. 도 9에 도시 된 바와 같이 그럼에도 불구하고, 분석은 임계 값의 넓은 범위에 대해 아주 강력하다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig1highres.jpg" width="500" /> 도 1. 콜로니 외관 분포를 생성하기 위해 필요한 단계의 개략도. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig2highres.jpg" width="500" /> 그림 2. 연결된 스캐너 및 구성 파일의 이름을 표시하는 장치 관리자의 스크린 샷. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/5456/51456fig2highres.jpg" target="_blank">큰를 보려면 여기를 클릭하세요</a>이 그림의 버전입니다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig3highres.jpg" width="500" /> 스캔 관리자의 그림 3. 스크린 샷. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig4highres.jpg" width="500" /> 그림 4. ScanLagApp의 스크린 샷. 판의 이미지는 왼쪽 창에 있고, 설명서에 설명 된대로 각 식민지의 성장 곡선은 오른쪽 창에 있습니다. 두 개 이상의 식민지 병합 때 식민지 영역 곡선의 일부에 스파이크가 발생합니다. 식민지 병합하는 상황이 발생하면,이 식민지의 영역은 공동 영역으로 간주됩니다. <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig5highres.jpg" width="500" /> 도 5. 한 플레이트의 분석의 대표적인 결과. (A) 실험의 끝에 검출 애플리케이션의 출력 이미지. 각 콜로니 영역은, 식별 된 컬러와 고유 ID 번호가 할당된다. 화살표는 콜로니 (강도 임계치에 기초하여 검출된다 B. 측정 대표 콜로니를 가리는 LB 한천 또는 M9 한천 E. 대장균 콜로니를 들어이 임계 값은 0.03이다. 다른 미디어 나 세균이 임계 값은 함수 ProcessPictures 조정할 수있다 ). 10 픽셀 이상 개체 만 (이 임계 값은 함수 MatchColonies에서 수정할 수 있습니다) 계산됩니다. 식민지의 검출은 약 10 5 박테리아에서 시작한다. 이 판에있는 네 개의 대표적인 식민지의 시간에 대한 픽셀 영역 (B) 플롯. 콜로니가 검출 될 때 각 콜로니 &#39;등장 시간&#39;이다. 시간이 이리저리 성장을 각 식민지의 성장 시간은 &#39;여기에 정의되어80 픽셀 (그 경계 기능 getAppearanceGrowthByVec를 사용하여 조정 가능하다)로 M (20) 픽셀. 이 소프트웨어는 상한에 도달하기 전에 합병 식민지를 제외합니다. 그 특성에 따라 특정 집단의 식별은 식별 번호와 각 식민지에 할당 된 색상에 쉽게 감사합니다. 예를 들어 중 1 식민지, 56, 77 및 124 두 그래프에서 강조 표시됩니다. <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig6highres.jpg" width="500" /> 그림 6. 외관 정량화 바이 모달 지연 시간 분포를 공개 할 수 있습니다. 두 가지 변종에 대한 외관 시간의 ScanLag 분석 히스토그램의 비교. 블루 라인 : 야생 균주가 기하 급수적으로 (총 : 1,320 식민지를) 성장; 보온 박테리아 (: 1,529 식민지 전체)과 풍부한 레드 라인 높은 지속성 돌연변이. (A) 표준화 모양 히스토그램. 피크기하 급수적으로 증가하고 세포의 모양으로 검출 식민지로 성장하는 전형적인 시간이다. 인셋 : 바이 모달 래그 타임의 분포를 나타내는 로그 이격 된 빈들의 실제 지연 시간을 얻기 위하여, 지수 문화의 피크 시간을 뺀 후 변이주의 동일 히스토그램. (B) 로그 스케일의 (A)에서와 같은 데이터의 생존 기능. 이 표현은 돌연변이 균주의 늦은 모양의 꼬리를 강화한다. <img alt="그림 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" width="500" /> 도 7. 외관 분포와 성장 시간 분포. (A)와 (B)는 두 차원 외형 시간의 히스토그램과 두 개의 서로 다른 조건 (소프트웨어가 상한에 도달하기 전에 병합 콜로니를 제외한다)의 성장 시간을 나타낸다. (C) 히스토그램을 비교성장 시간 (D)가 비슷한 반면 두 균주의 출현 시간의 차이는 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig8highres.jpg" width="500" /> 도 8. 초기 콜로니 외관 이후 콜로니의 모양을 방해하지 않는다. (A) 단독 도금 야생형 세포의 시간 분포를 지연. (B) 허용하는 온도로 전송 한 후, 혼자 추위에 민감한 긴장의 시간 분포를 지연. (C)는 동일한 조건에서 함께 도금 두 균주의 시간 분포를 지연. 블랙 라인은 별도로 각 스트레인을 측정 할 때 얻어진 데이터에 기초하여 예상 분포를 나타낸다. 좋은예상과 측정 분포간에 greement은 긴 플레이트 당 콜로니의 총 수가 200 이하로 얻어진다. <img alt="그림 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig9highres.jpg" width="500" /> ..도 9 검출 임계치는 콜로니 외형 분포의 형상에 영향을주지 않는 콜로니 외관 분포는 두 개의 서로 다른 임계 크기를 사용하여 동일한 데이터 세트에 대해 분석 하였다; (A)의 임계 크기는 10 픽셀입니다; (B) 임계 값의 크기가 50 픽셀이다. 히스토그램 당 셀 수 : 약. 1500. 다른 검출 임계치는 검출 시간의 시프트 초래한다. <img alt="그림 10" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig10highres.jpg" width="500" /> 10. 온도 안정성 측정 ACR 그림전원 관리하지 않고 스캐너를 성장 바실러스 subtillis의 식민지와 접시의 OSS 스캐너의 표면. (A) 이미지. 표면은 바닥에 워머 따라서 콜로니 빠르게 성장한다. 플레이트 옆 점진적 라인 열 구배의 개략도이다. (B)의 온도 안정성은, 스캐너의 표면에 걸쳐 배치 된 두 개의 써모 커플로 측정 하였다. 스캐너는 각 스캔 동안과 시간이 지남에 가열한다. (C) 전원 관리를 사용, 온도가 균일하고 식민지 비슷한 속도로 성장한다. (D) 전원 관리 모듈 (B)과 동일합니다. ± 0.2 ° C의 온도 안정성 <img alt="그림 11" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig11highres.jpg" width="500" /> 그림 11. 모양의 분포의 차이는 디 원인 일 수 있습니다고체 배지의 볼륨에 fferences. 동일한 세균 배양 한천 표면의 다른 높이의 결과, LB 한천의 다른 볼륨으로 플레이트 상에 플레이 팅 하였다. 서로 다른 높이가 접시의 다른 불투명도, 따라서 다른 검출 시간에했다. 간 판의 차이를 확인하고 서로 다른 높이의 조건의 차이했다. LB 한천의 30 ± 0.5 ml의 같은 부피의 판 사이 (A) 일반적인 차이. 서로 다른 높이의 조건 사이의 (B)의 차이는 : 모양 분포는 30 ± 0.5 ㎖ (녹색)의 40 ± 0.5 ㎖ (블루)의 20 ± 0.5 ㎖ (빨간색)의 볼륨과 번호판을 측정 하였다. 각 조건은 6 개의 다른 판의 평균입니다. 긴 플레이트의 양이 ± 5 ㎖의 범위 내에있는 한, 불투명도가 유사하고 유사한 외관 시간 분포에 이르게한다.

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ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

ScanLag : 높은 처리량 식민지 성장의 정량화 및 시간 지연

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

scanlag-high-throughput-quantification-of-colony-growth-and-lag-time

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.1K 조회수.  The Hebrew University of Jerusalem. ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

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High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

연구

면역학 및 감염병학

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

파지 - 표시 합성 항체 라이브러리의 확장 성 높은 처리량 선택

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

높은 처리량 정량 실시간 RT-PCR 분석 유형 I과 III 인터페론 하위 유형의 발현 양상을 결정하는

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

높은 처리량 유전자 태그에<em&gt; 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

높은 처리량, 높은 콘텐츠, 액체 기반의 C. 선 충 Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...