이 작품은 SARS-CoV-2에 대한 연구를 위해 과학 고등 교육부에 의해 지원되었으며 국립 과학 센터 (UMO2017/27 /B / NZ6 /02488에서 K.P.와 UMO-2018/E/NZ1/00874 ~ A.K.K.P.의 보조금)을 지원했습니다.

1. 버퍼 준비
<ol><li>2x PHEM 버퍼500mL의 경우 18.14 g의 파이프라진-N,N,N-bis(2-에탄설포닉산) (파이프S), 6.5 g4-(2-하이드록예트)를 결합합니다. hyl)-1-파이프라진 에탄 에탄황포닉산(HEPES), 에틸렌 글리콜 테트라아세산(EGTA), 황산 마그네슘 0.99g(MgSO4). 증류수(dH2O)로최대 ~400mL의 부피를 만들고, 수산화칼륨(KOH) 또는 수산화나트륨(NaOH)을 사용하여 pH를 7.0으로 조정한다. 최종 볼륨을 최대 500mL로 한 다음 50mL 알리쿼트로 분할합니다. 필요할 때까지 -20°C에 보관하십시오. 참고: pH가 7.0에 도달할 때까지 버퍼가 명확하지 않습니다.</li>
	<li>/v 파라포름데히드(PFA)를 37% 순매수한다. 50mL의 경우 18.5g의 PFA와 35mL의 dH2O를 유리 병에 섞는다. 가열마그네틱 교반기 위에 병을 놓습니다. 1M KOH 또는 NaOH의 900 μL을 추가하고 용액이 명확해질 때까지 저어줍니다. 식히고 50mL 원심분리기 튜브로 이송할 수 있습니다. dH2O로 최대 50mL를 차지합니다. 용액은 필요할 때까지 -20 °C에서 저장할 수 있습니다. 참고: 포름알데히드는 보호 장갑과 실험실 코트를 착용하는 동안 연기 후드로 처리해야합니다.</li>
	<li>고정 버퍼를 준비합니다(PHEM으로 버퍼링된 PFA 3.7%). 50mL의 경우 5mL 37% PFA 용액 5mL, 2x PHEM 버퍼 25mL, dH2O20mL를 50mL 원심분리관에 결합한다. 필요할 때까지 -20°C에 보관하십시오. 참고: 해동 후 버퍼를 최대 3개월 동안 4°C로 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>PBST준비(1x 인산염 완충식염[PBS]에서 0.1% Tween-20)을 준비한다. 50mL의 경우 100% Tween-20 ~ 50mL의 50 μL을 1x PBS로 추가하고 잘 섞습니다. 참고: 솔루션은 실온(RT)에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>3:1, 1:1 및 1:3의 비율로 MeOH/PBST를 결합하여 재수화 버퍼를 준비합니다(각 값의 100mL의 최종 부피; 표 1참조). 참고 : MeOH는 매우 독성과 인화성입니다. 시신경을 손상시킬 수 있으므로, 어떤 화염을 피하는 연기 후드에서 처리해야합니다. MeOH와 PBST를 혼합하면 비동반응을 일으키므로 얼음에 대한 솔루션을 결합합니다.</li>
	<li>20x SSC의 1000mL의 경우, 염화나트륨 175.3g과 구연산 나트륨 88.2g을 비커에 넣고, 800mL의 dH2O. 저어서 녹을 때까지 저어주어 NaOH를 사용하여 7.2로 pH를 조정한다. dH2O를 총 부피 1000mL에 추가하고 0.22 μm 필터를 통해 오토클레이브 또는 필터링을 오토클레이브 병에 넣습니다.</li>
	<li>5x SSCT의 50mL의 경우 20x SSC 버퍼 12.5mL과 dH2O 37.5mL을 결합하고 100% Tween-20의 50 μL을 추가합니다. 잘 섞으세요.</li>
	<li>50% 5x SSCT/50% PBST의 50mL의 경우 25mL의 5x SSCT와 25mL의 PBST를 결합하십시오.</li>
	<li>2x SSC의 50mL의 경우, 10x SSC 버퍼 5mL과 dH2O. 믹스45mL을 잘 결합합니다. 참고: 모든 SSC 버퍼는 어두운 곳에 RT에 저장해야 합니다.</li>
</ol>2. 표적 정의, 프로브 및 증폭기
<ol><li>제조업체 의 웹 사이트에서 사용할 수있는 도구를 사용하여 앰프 및 프로브를 설계하십시오. 프로브가 SARS-CoV-2 N유전자(보충 도 1)의역DNA 가닥에 상보적이있는지 확인합니다.</li>
	<li>최상의 프로브 집합 크기를 결정합니다(20개의 프로브 집합이 시각화에 충분합니다).</li>
	<li>표적 RNA 검출에 사용되는 증폭기를 설정합니다.<ol>
<li>알렉사 플루어 647로 표시된 HCR 앰프 B1을 사용하십시오. 참고: HCR 앰프는 메타안정HCR 헤어핀 h1 및 h2로 구성됩니다. 멀티플렉스 실험은 이 프로토콜을 사용하여 설계할 수 있습니다. 이 계획된 경우, 동일한 샘플 내에서 이미지되는 각 표적 RNA에 대해 다른 HCR 증폭기(B1, B2, ...)를 선택하십시오(예를 들어, 표적 1용 앰프 B1, 표적 2용 앰프 B2,...).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. SARS-CoV-2를 가진 세포 배양 및 감염
<ol><li>배양 베로 (원숭이 신장 상피 세포) 덜벡코의 수정 된 독수리 배지에서 세포 5% 태아 소 혈청을 포함.<ol>
<li>12웰 플레이트에 50,000개의 셀을 커버립(1번, 15번 × 15mm)에 시드합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>투과성 트랜스웰 인서트지지체(직경 = 6.5mm)와 기관지 상피 성장 배지에서 완전히 분화된 HAE 배양을 완전히 컨블릴 때까지 준비한다.</li>
	<li>바이러스 감염<ol>
<li>1000x 중간 조직 배양 전염량(TCID 50)에서 SARS-CoV-2를 가진 접종 세포 (TCID50)mL 당</li>
		<li>37°C에서 2h의 세포를 배양합니다.</li>
		<li>PBS로 셀을 두 번 세척하여 언바운드 바이러스를 제거합니다.</li>
		<li>48 h용 배양 세포.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 커버립에 배양된 베로 세포에서 SARS-CoV-2 RNA-FISH
1일차
<ol><li>세포 고정 및 투과성<ol>
<li>감염된 세포를 RT에서 1h에 대해 3.7%w/v PFA 용액으로 수정합니다.</li>
		<li>3.7% PFA 용액을 흡인하고 1x PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다.</li>
		<li>동요와 RT에서 10 분 동안 PBST 용액으로 세포를 과미로 처리합니다.</li>
		<li>PBST를 흡인하고 1x PBS로 셀을 두 번 세척합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>탐지<ol>
<li>1x PBS 용액을 흡인하고 RT에서 2배 SSC로 셀을 두 번 세척합니다.</li>
		<li>2x SSC 용액을 흡인하고, 프로브 혼성화 버퍼의 최소 300μL을 추가하여 시료를 미리 혼성화한다. 세포를 포함하는 우물을 덮고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.</li>
		<li>프로브 혼성화 버퍼에 프로브 혼합물의 1.2 pmol을 추가하여 프로브 용액을 준비합니다.<ol>
<li>1 μM 프로브 스톡의 1.2 μL을 사용하여 작업 재고 300 μL을 준비하십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>사전 혼성화 용액을 제거하고 커버립을 가습 챔버로 옮기습니다.<ol>
<li>피펫 30-50 μL의 프로브 용액이 파라필름에 들어와 개별 물방울을 형성합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>37°C에서 하룻밤 사이에 시료(12-18h)를 배양한다. 2일차</li>
		<li>커버립을 다시 12웰 플레이트로 옮기고, 37°C에서 400μL의 프로브 세척 버퍼로 4 x 5분 동안 세척하여 여분의 프로브 용액을 제거합니다. 참고: 30-50 μl 알리쿼트를 파라필름과 인큐베이션커버립 아래에 배치하는 대안으로, 300μL의 프로브 용액을 12웰 플레이트의 커버립에 직접 추가합니다. 이 절차는 간단하지만 상당한 양의 시약이 필요합니다. 사용하기 전에 프로브 세척 버퍼를 37 °C로 가열합니다. 필요한 버퍼의 양을 계산하고 15 mL 원심 분리튜브로 전송합니다.</li>
		<li>RT에서 5배 SSCT로 2 x 5분 동안 샘플을 세척합니다.</li>
		<li>5x SSCT 용액을 1x PBS로 교체하고 증폭될 때까지 샘플을 4°C로 저장합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>증폭<ol>
<li>우물에서 1x PBS 용액을 제거하고 증폭 버퍼의 최소 300 μL을 각 웰에 추가합니다. RT에서 30분 동안 샘플을 배양합니다.</li>
		<li>각 HCR 헤어핀(h1 및 h2)을 별도의 튜브에서 원하는 볼륨을 스냅 냉각하여 준비합니다.<ol>
<li>증폭 용액의 300 μL을 준비하려면 각 헤어핀의 18 pmol을 사용하십시오 (예 : 300 μL의 경우 3 μM 스톡 헤어핀 용액의 6 μL을 사용하십시오).</li>
			<li>헤어핀 용액을 튜브로 옮긴다.</li>
			<li>90s용 95°C에서 배양합니다.</li>
			<li>어둠 속에서 30 분 동안 RT로 식힙니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>증폭 버퍼에 스냅 냉각 "h1"과 "h2"헤어핀을 추가하여 헤어핀 혼합물을 준비합니다.</li>
		<li>30-50 μL의 헤어핀 혼합물을 파라필름에 놓습니다.</li>
		<li>RT의 어둠 속에서 하룻밤 사이에 샘플을 배양 (12-18 h). 3일차</li>
		<li>커버립을 12웰 플레이트로 다시 옮기고, RT에서 5x SSCT로 5x 5분 동안 세척하여 과도한 헤어핀을 제거합니다.</li>
		<li>5배 SSCT 버퍼를 흡인하고 1배 PBS로 바꿉니까. 참고: 필요한 경우, 표준 면역 형광 분석에서 RNA-FISH 샘플을 사용하고 핵염색(섹션 5 참조).</li>
	</ol></li>
	<li>핵 염색 및 슬라이드 장착<ol>
<li>1x PBS 용액을 흡인하고 1x PBS 솔루션에서 4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI, 0.2 μg/mL)로 대체하십시오.</li>
		<li>어둠 속에서 RT에서 10 분 동안 샘플을 배양합니다.</li>
		<li>DAPI 용액을 흡인하고 1배 PBS로 셀을 두 번 세척합니다.</li>
		<li>장착 매체의 각 10 μL의 두 방울을 놓습니다; 두 개의 커버립을 단일 슬라이드에 배치할 수 있도록 방울이 충분히 분리되었는지 확인합니다.</li>
		<li>깨끗한 수건에 덮개를 눌러 여분의 액체를 제거한 다음, 셀이 아래로 향하는 안티페이드 장착 배지에 넣습니다.</li>
		<li>장착된 샘플을 건조하고 평평한 표면에 어둡게 놓고 치료하게 합니다.</li>
		<li>경화 후, 샘플이 건조되지 않도록 VALAP 실란트 또는 매니큐어로 커버립의 가장자리를 밀봉하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>5. HAE 배양에서 SARS-CoV-2 RNA-FISH
1일차
<ol start="1"><li>해문화 의 고치고 침투<ol>
<li>매체를 흡인시키고, RT에서 1h용 3.7% PFA 용액을 사용하여 감염된 세포를 수정한다.</li>
		<li>3.7% PFA 용액을 흡인하고, 1배 PBS로 셀을 두 번 세척한다.<ol>
<li>3.7% PFA 용액을 트랜스웰 인서트 에서 1배 PBS로 교체합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>PBS를 폐기하고 - 20 °C에 100 % MeOH로 2 x 5 분 세차스를 사용하여 샘플을 탈수합니다.</li>
		<li>두 번째 세척 후, 트랜스웰 인서트 에서 투과화를 위해 버퍼를 신선하고 차가운 MeOH로 교체하십시오. -20 °C에서 하룻밤 을 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2일차
<ol start="2"><li>리하이드레이션 얼음에 MeOH/PBST 솔루션(각각 5분)의 등급이 매겨진 계열, 50% MeOH/50% PBST, 25% MeOH/75% PBTS, 100% PBST(2회)를 통해 샘플을 재수화합니다.<ol>
<li>50% 5x SSCT/50% PBST로 얼음에 5분 동안 셀을 세척합니다.</li>
		<li>5배 SSCT로 얼음에 5분 동안 셀을 세척합니다.</li>
		<li>5x SSCT 버퍼를 1배 PBS로 바꿉니까.</li>
	</ol>
</li>
	<li>탐지<ol>
<li>프로브 혼성화 버퍼의 100 μL와 얼음에 5 분 동안 셀 (트랜스 웰 삽입 내부)를 배양. 다음으로, 플레이트를 37°C(사전 혼성화)에서 30분 동안 인큐베이터로 옮는다. 참고: 프로브 혼성화 버퍼는 사용하기 전에 37°C로 예열되어야 합니다. 필요한 체적을 계산합니다: 단일 Transwell 인서트에 100 μL이 필요합니다.</li>
		<li>프로브 솔루션을 준비합니다. 프로브 용액 1mL에 4pmol의 프로브가 필요하므로 1 μM 프로브 스톡 솔루션의 4 μL을 프로브 혼성화 버퍼 1mL에 추가하고 잘 혼합합니다. 참고: RNA 검출의 경우 트랜스웰 인서트당 100 μL의 프로브 용액을 사용하십시오. 프로브 용액을 사전 혼성화 단계가 끝날 때까지 얼음 위에 둡니다.</li>
		<li>사전 혼성화 솔루션을 제거하고 프로브 솔루션을 추가합니다.</li>
		<li>세포를 37°C에서 하룻밤 동안(12-18h)으로 배양한다. 3일차</li>
		<li>37°C에서 프로브 세척 버퍼 100μL로 4 x 15분 동안 세척하여 여분의 프로브를 제거합니다.</li>
		<li>RT에서 5배 SSCT로 샘플을 2 x 5분 동안 세척합니다.</li>
		<li>5x SSCT를 1x PBS로 교체하고 증폭될 때까지 샘플을 4°C로 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>증폭<ol>
<li>RT에서 30분 동안 증폭 버퍼로 샘플을 배양하여 시료를 미리 배양합니다.</li>
		<li>별도의 튜브에서 원하는 볼륨을 스냅 냉각하여 각 헤어핀을 준비합니다.<ol>
<li>증폭 용액 500 μL을 준비하려면 각 헤어핀의 30 pmol을 사용하십시오 (예 : 500 μL의 경우 3 μM 스톡 헤어핀 용액의 10 μL을 사용하십시오).</li>
			<li>헤어핀 용액을 튜브로 전송합니다.</li>
			<li>90s용 95°C에서 배양합니다.</li>
			<li>어둠 속에서 30 분 동안 RT로 식힙니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>모든 스냅 냉각 헤어핀을 RT에서 증폭 버퍼의 500 μL에 추가하여 헤어핀 솔루션을 준비합니다.</li>
		<li>사전 증폭 솔루션을 제거하고 전체 헤어핀 솔루션을 추가합니다.</li>
		<li>어둠 속에서 RT에서 하룻밤 (12-18 h)에 샘플을 배양.</li>
		<li>2 x 5 분, 2 x 15 분, 1 x 5 분 : 다음과 같이 RT에서 5 배 SSCT로 세척하여 과도한 헤어 핀을 제거합니다.</li>
		<li>5x SSCT 용액을 1x PBS로 교체하고 4°C에 저장하여 2-3일 이상 보관하거나 핵 염색으로 직접 진행하십시오. 참고: 필요한 경우 표준 면역 형광 분석에서 RNA-FISH 샘플을 사용하고 핵 염색(섹션 6 참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>핵 염색 및 슬라이드 장착<ol>
<li>1x PBS 용액을 흡인하고 1x PBS에서 DAPI 용액(0.2 μg/mL)으로 교체합니다.</li>
		<li>어둠 속에서 RT에서 10 분 동안 샘플을 배양합니다.</li>
		<li>DAPI 용액을 흡인하고 1배 PBS로 셀을 두 번 세척합니다.</li>
		<li>트랜스웰 인서트에서 잘라낸 멤브레인을 10μL에 놓고 셀이 위를 향하도록 하는 안티페이드 장착 배지의 10μL에 놓고 멤브레인에 추가 장착 매체(5 μL)를 추가합니다.</li>
		<li>커버립으로 멤브레인을 덮습니다.</li>
		<li>어두운 건조한 평평한 표면에 장착된 시료를 치료합니다.</li>
		<li>경화 후, 샘플이 건조되지 않도록 VALAP 실란트 또는 매니큐어로 커버립의 가장자리를 밀봉하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 베로 세포 및 HAE 배양의 면역 형광 분석
참고: HAE 배양을 위해 세포주 또는 4일째에 대한 면역형광 분석을 3일째에 수행한다. 각 모델에 대해 다른 접근 방식을 사용합니다. 모든 차이점은 명확하게 표시됩니다.
<ol><li>우물에서 1x PBS 솔루션을 흡인합니다.</li>
	<li>PBST 용액에서 소 세럼 알부민을 1%w/w/w/37°C에서 30분 동안 인큐베이션하여 시료를 차단합니다.</li>
	<li>차단 용액에 적절한 희석을 준비하여 1 차 항체를 준비하고 인큐베이션하십시오.<ol>
<li>커버립의 베로 셀의 경우:<ol>
<li>습도 챔버에서 파라필름에 항체 용액의 방울(30-50 μL)을 놓습니다.</li>
			<li>커버립을 항체 방울에 놓고 세포가 아래로 향하도록 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>HAE의 경우, 인서트의 차단제를 항체 용액(100 μL)으로 교체하고 가습 챔버에서 시료를 배양한다. 참고: 1차 항체로 각 배양의 시간과 온도를 조정합니다. 일반적인 매개 변수는 RT에서 2 시간 또는 4 °C에서 하룻밤입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBST로 샘플을 3 x 5분 동안 세척합니다.<ol>
<li>커버립의 셀의 경우 12웰 플레이트로 옮기고 PBST 용액을 추가합니다.</li>
		<li>HAE 배양의 경우 항체 용액을 PBST 용액으로 대체하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>공초점 현미경에 사용할 수 있는 광원과 필터를 확인합니다.</li>
	<li>숙주 종에 따라 이차 항체를 선택하십시오. 플루오로포레 파라미터(사용 가능한 광원에 따라 발아 및 방출 파장, 스펙트럼 너비 및 흥분 효율)을 선택합니다. 참고: 스펙트럼 매개 변수는 온라인 도구를 사용하여 모델링할 수 있습니다(재료 표참조).</li>
	<li>차단 용액으로 희석하여 적절한 이차 항체 용액을 준비하십시오.</li>
	<li>이차 항체(6.3에서와 같이)로 배양하지만 37°C에서 1h의 배양을 한다.</li>
	<li>6.4 단계에서와 같이 샘플을 세척하십시오.</li>
	<li>핵 염색 및 슬라이드 장착<ol>
<li>커버립의 셀용<ol>
<li>PBST를 흡인하고 1x PBS 용액에서 DAPI(0.2 μg/mL)로 바꿉니다.</li>
			<li>어둠 속에서 RT에서 10 분 동안 샘플을 배양합니다.</li>
			<li>DAPI 용액을 흡인하고 1배 PBS로 셀을 두 번 세척합니다.</li>
			<li>커버립을 장착 매체의 10 μL 방울에 놓고 셀이 아래로 향합니다.</li>
			<li>매니큐어로 커버립을 밀봉합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>HAE 문화를 위한<ol>
<li>1x PBST를 흡인하고 1x PBS 용액에서 DAPI(0.2 μg/mL)로 바꿉니다.</li>
			<li>어둠 속에서 RT에서 10 분 동안 샘플을 배양합니다.</li>
			<li>DAPI 용액을 흡인하고 1배 PBS로 셀을 두 번 세척합니다.</li>
			<li>절단 멤브레인을 장착 매체10μL의 방울에 놓고 셀이 위향을 향하도록 하고 멤브레인에 추가(5 μL) 장착 매체를 추가합니다.</li>
			<li>커버립으로 멤브레인을 덮습니다.</li>
			<li>매니큐어로 커버립을 밀봉합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 공초점 현미경 검사법
<ol><li>사용된 형광을 지정하여 트랙을 정의합니다.</li>
	<li>스캐닝 모드와 속도를 선택합니다.</li>
	<li>각 형광에 대한 레이저 전력, 게인 및 오프셋 값을 각각의 부정적인 컨트롤과 비교하여 조정합니다: 바이러스, 모의 감염 세포; 세포 단백질의 경우, 적절한 숙주에서 등류형 대조군 항체로 염색된 샘플.</li>
	<li>3D 이미지를 가져오려면 z 스택 모드를 활성화하고 상단 및 하단 제한을 설정합니다. 단계 크기/번호를 설정합니다. 참고: 코로나바이러스 이미징에 대한 자세한 내용은19를참조하십시오.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Choi, H. M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third-generation+in+situ+hybridization+chain+reaction:+multiplexed,+quantitative,+sensitive,+versatile,+robust.">Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust.</a> Development. 145, (2018).</li><li>Milewska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+2+in+human+respiratory+epithelium.">Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium.</a> Journal of Virology. 94, (2020).</li><li>Banach, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+epithelial+cell+culture+to+identify+new+respiratory+viruses:+coronavirus+NL63+as+a+model.">Human airway epithelial cell culture to identify new respiratory viruses: coronavirus NL63 as a model.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 19-26 (2009).</li><li>Milewska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+of+human+coronavirus+NL63+into+the+cell.">Entry of human coronavirus NL63 into the cell.</a> Journal of Virology. 92, (2018).</li><li>El Baba, R., Herbein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+epigenomic+networks+entailed+in+coronavirus+infections+and+COVID-19.">Management of epigenomic networks entailed in coronavirus infections and COVID-19.</a> Clinical Epigenetics. 12, 118 (2020).</li><li>Pinto, B. G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACE2+expression+is+increased+in+the+lungs+of+patients+with+comorbidities+associated+with+severe+COVID-19.">ACE2 expression is increased in the lungs of patients with comorbidities associated with severe COVID-19.</a> Journal of Infectious Diseases. 222 (4), 556-563 (2020).</li><li>Verdecchia, P., Cavallini, C., Spanevello, A., Angeli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pivotal+link+between+ACE2+deficiency+and+SARS-CoV-2+infection.">The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-CoV-2 infection.</a> European Journal of Internal Medicine. 76, 14-20 (2020).</li><li>Gordon, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SARS-CoV-2+protein+interaction+map+reveals+targets+for+drug+repurposing.">A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing.</a> Nature. 583, 459-468 (2020).</li><li>Ferron, F., Decroly, E., Selisko, B., Canard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+viral+RNA+capping+machinery+as+a+target+for+antiviral+drugs.">The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs.</a> Antiviral Research. 96 (1), 21-31 (2012).</li><li>Mehta, S., Jeffrey, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+receptors+and+signaling:+epigenetic+factors+in+the+regulation+of+innate+immunity.">Beyond receptors and signaling: epigenetic factors in the regulation of innate immunity.</a> Immunology and Cell Biology. 93 (3), 233-244 (2015).</li><li>Poppe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NF-kappaB-dependent+and+-independent+transcriptome+and+chromatin+landscapes+of+human+coronavirus+229E-infected+cells.">The NF-kappaB-dependent and -independent transcriptome and chromatin landscapes of human coronavirus 229E-infected cells.</a> PLoS Pathogens. 13, 1006286 (2017).</li><li>Schafer, A., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+landscape+during+coronavirus+infection.">Epigenetic landscape during coronavirus infection.</a> Pathogens. 6 (1), 8 (2017).</li><li>Carletti, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+priming+of+cell+intrinsic+innate+antiviral+signaling+by+the+unfolded+protein+response.">Viral priming of cell intrinsic innate antiviral signaling by the unfolded protein response.</a> Nature Communications. 10, 3889 (2019).</li><li>Heil, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+recognition+of+single-stranded+RNA+via+toll-like+receptor+7+and+8.">Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8.</a> Science. 303 (5663), 1526-1529 (2004).</li><li>Sze, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+restriction+factor+SAMHD1+limits+human+T+cell+leukemia+virus+type+1+infection+of+monocytes+via+STING-mediated+apoptosis.">Host restriction factor SAMHD1 limits human T cell leukemia virus type 1 infection of monocytes via STING-mediated apoptosis.</a> Cell Host and Microbe. 14 (4), 422-434 (2013).</li><li>Kikkert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+evasion+by+human+respiratory+RNA+viruses.">Innate immune evasion by human respiratory RNA viruses.</a> Journal of Innate Immunity. 12, 4-20 (2020).</li><li>Kennedy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+m(6)A+editing+of+HIV-1+mRNAs+enhances+viral+gene+expression.">Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression.</a> Cell Host and Microbe. 22 (6), 830 (2017).</li><li>Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-differentiated+human+airway+epithelial+cell+cultures.">Well-differentiated human airway epithelial cell cultures.</a> Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).</li><li>Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+coronavirus+entry+into+cells.">Visualizing coronavirus entry into cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).</li></ol>

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

면역 RNA-FISH는 RNA 와 세포 단백질의 이중 염색을 위한 신뢰할 수 있는 방법입니다. 여기서, 변형된 면역-RNA-FISH 프로토콜은 세포주 및 HAE 배양에서 SARS-CoV-2 RNA 및 세포단백질의 검출을 가능하게 하는 것으로 기술되었다. 이 프로토콜은 세포 단층 또는 특정 조직을 포함하는 다른 세포 모형에서 사용하기 위하여 적응될 수 있습니다. 이 방법은 적절한 프로브 현지화로 시작된 HCR의 개념에 의존합니다...

SARS-CoV-2는 2019년 말에 등장한 새로운 인간 베타코로나바이러스로, 몇 달 후 전례 없는 전염병을 일으켰습니다. 바이러스는 과학에 새로운 때문에, 그것의 생물학및 호스트 세포에 그것의 충격의 대부분은 알려지지 않은 남아 있습니다. 따라서, 감염 시 바이러스 세포 및 조직 트트로피를 매핑하는 것은 그것의 기본적인 생물학적 특성 및 호스트에 대한 그 효력이 이해되어야 하는 경우에 중요합니다. 몇몇 기술은 생화학, 생물학 및 물리적 분석을 포함하여 바이러스 호스트 상호 작용을 검토하기 위하여 이용됩니다. 시상 혼성화는 세포 또는 조직에서 특정 DNA 또는 RNA 서열에 국한되는 표지된 상보DNA, RNA 또는 변형된 핵산 프로브를 사용하는 일반적인 방법입니다.
신분 혼성화(RNA-FISH) 방법의 새로운 RNA 형광은 HCR1을통해 신호 대 잡음 비율을 증폭시킴으로써 감도를 높이기 위한 변형을 통합하는 것으로 개발되었다. HCR은 단세포 수준에서 RNA 현지화의 연구를 허용합니다. 높은 특이성, 감도 및 해상도로 인해 이 방법은 기초 과학 연구뿐만 아니라 진단과 같은 적용 프로젝트에도 유용합니다. 최근에는, 본 방법의 타당성은 완전히 분화된 3D 인간기도 상피(HAE) 배양2내의 섬모 세포에 국소화된 SARS-CoV-2 RNA를 검출하기 위한 것이 입증되었다. HAE 배양은 "자연 감염" 마이크로환경3,4의맥락에서 바이러스 감염을 연구하는 데 사용되는 가장 진보된 도구 중 하나를구성한다.
SARS-CoV-2를 포함한 인간 코로나바이러스(HCoV)에 대한 여러 보고서는 HCoV 감염 및 병리학에 대한 후성유전학적 변형의 중요성을 강조합니다[5], 예를 들어, 안지오텐신 변환 효소 2(ACE-2) 수용체2를코딩하는 유전자의 메틸화 패턴, 예를 들어, 후성유전학적 변형의중요성을강조한다. 흥미롭게도, 질량 분광 스크리닝 은 SARS-CoV-2 proteome 8과 상호 작용하는 몇몇 후성 유전학 요인을확인했습니다. 보다 구체적으로, 비구조적 단백질 5(NSP5)는 후생유전학 적 레귤레이터에 결합하고, 히스톤 deacetylase 2, 및 촉매비활성 NSP5(C145A)는 tRNA 메틸트랜스퍼라제 1(24)과 상호작용한다. 또한, NSP16 메틸트랜스퍼효소 활성은 메틸트랜스퍼효소 억제제, 시네풍진9에의해 차단된다. 그러나, COVID-19에 있는 이 후성유전학 요인의 정확한 역할은 불분명합니다. HCoV의 복제는 감염된 세포의 세포질에서 일어나고, 후성 유전학 수정에 의해 조절되는 염증 반응을트리거10.
예를 들어, HCoV-229E 미세 조정 핵 인자-카파 B 시그널링 및 특정 지역에서 H3K36 및 H4K5의 아세틸화를 증가시켜 호스트 셀룰러 크로마틴 풍경을 심오하게 재프로그램11. 중동 호흡기 증후군 관련 코로나바이러스 감염은 H3K27me3의 수준을 증가시키고 특정 인터페론 에민감한 유전자의 서브세트의 프로모터 영역에서 H3K4me3을고갈시킨다(12). 또한, 바이러스 RNA는플라비바이러스(13),레트로바이러스14,15,및 코로나바이러스(16)에 대해 입증된 바와 같이 세포 면역 반응을 유발한다. 바이러스 RNA에 후성 유전학 마커는 인간 면역 결핍 바이러스-1 RNA17의m7A 메틸화에 대해 도시된 바와 같이 세포 센서에 의해 인식에 역할을 할 수 있다. 그러나, 질문은 남아 있습니다: 면역 반응에 SARS-CoV-2 RNA의 충격은 무엇이며, 후성 유전학 표시는 관련되습니까?
여기서, 세포주 및 3D 조직의 면역형광 분석과 결합된 최적화된 RNA-FISH 방법(완전히 분화된 HAE)이 설명되고 있다. FISH 및 면역형광과 같은 세포학적 방법이 널리 사용되지만, HCR을 기반으로 한 시상 혼성화 방법의 이 신세대는 바이러스 검출에 사용된 적이 없다(최근 간행물을 제외하고)2. 일반적으로 면역 염색 및 FISH는 다음과 같은 단계를 필요로 합니다: 프로브 또는 항체의 침투를 가능하게 하기 위하여 투과성; 셀룰러 물질이 고정되고 보존되는 고정; 항체 또는 핵산 프로브가 적용되는 검출; 마지막으로 시각화를 위한 샘플 장착.
기존 프로토콜은 이러한 일반적인 기능을 공유하지만 관련된 매개 변수와 관련하여 현저하게 다릅니다. 여기서, 최적화된, 간단한, 면역 RNA-FISH 프로토콜은 HAE 배양 및 베로 세포에서 SARS-CoV-2 RNA를 검출하기 위하여 기술되었다. 기술은 다음과 같은 단계를 포함한다: (1) 파라포름알데히드를 가진 세포의 고정; (2) 세제 또는 메탄올과 과구 (MeOH); (3) 등급이 매겨진 일련의 MeOH 솔루션을 통한 재수화(HAE 배양만); (4) 검출; (5) HCR 기술을 이용하여 증폭하여 SARS-CoV-2 RNA를 검출하는; (6) 면역 염색; 및 (7) 공초점 현미경의 밑에 화상 진찰.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Equipment</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Confocal Microscope LSM 880</td>
			<td >ZEISS </td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grant Bio, Mini Rocker- Shaker</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td>12965501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator Galaxy170R</td>
			<td >New Brunswick</td>
			<td>CO170R-230-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermomixer Comfort</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td>5355 000 011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips</td>
			<td >LabSolute</td>
			<td >7695022</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5 mL tubes</td>
			<td >FL-MEDICAL</td>
			<td >5.350.023.053</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12-well plate</td>
			<td >TTP</td>
			<td >92412</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conical centrifuge tube</td>
			<td >Sarstedt</td>
			<td >5.332.547.254</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >parafilm</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P7793-1EA</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >serological pipets</td>
			<td >VWR Collection</td>
			<td >612-5523P, 612-5827P</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >slide glass</td>
			<td >PTH CHEMLAND</td>
			<td >04-296.202.03</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Transwell ThinCerts</td>
			<td >Grainer bio-one</td>
			<td >665641</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#946;5-tubulin </td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td > sc-134234</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >D1306</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disodium phosphate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >S51136-500G</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EGTA</td>
			<td >BioShop</td>
			<td >EGT101.25</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR Amplification Buffer</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >BAM01522</td>
			<td >Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >S013922</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >S012522</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR Probe Hybridization Buffer</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >BPH03821</td>
			<td >Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >PRE134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR Probe Wash Buffer</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >BPW01522</td>
			<td >Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >BioShop</td>
			<td >HEP001.100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >63138-250G</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >32213-1L-M</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monopotassium phosphate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P5655-100G</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6148-1KG</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PIPES</td>
			<td >BioShop</td>
			<td >PIP666.100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Chloride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P5405-250G</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Prolong Diamond Antifade Mounting Medium</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >P36970</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td >BioShop</td>
			<td >SOD001.5</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trisodium Citrate 2-hydrate</td>
			<td >POCH</td>
			<td > 6132-04-3</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tween-20</td>
			<td >BioShop</td>
			<td >TWN580.500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescence Spectraviewer</td>
			<td ></td>
			<td></td>
			<td>Modeling spectral parameters</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ Fiji</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >Acquiring and processing z-stack images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of sars-cov-2 using immuno rna-fluorescence in situ hybridization

본 원고는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) RNA를 인간 기도 상피의 3차원(3D) 배양으로 시각화하기 위해 면역형광과 결합된 시상 혼성화 연쇄 반응(HCR)에서 프로토콜을 제공한다. 이 방법은 프로브 국소화에 의해 시작된 HCR에 의존하여 바이러스 RNA의 매우 구체적이고 민감한 시각화를 허용합니다. 분할 시이터 프로브는 형광으로 표지된 증폭기로 신호를 증폭시켜 공초점 현미경 검사법의 무시할 수 있는 배경 형광을 초래합니다. 다양한 형광염료를 가진 앰프를 라벨링하면 다양한 표적을 동시에 인식할 수 있습니다. 이것은, 차례차례로, 단세포 수준에서 바이러스성 병인 및 복제를 더 잘 이해하기 위하여 조직에 있는 감염의 매핑을 허용합니다. 면역 형광과 이 방법을 결합하면 숙주 후성 유전체 및 면역 반응 경로의 교대를 포함하여 숙주 바이러스 상호 작용에 대한 더 나은 이해를 촉진 할 수 있습니다. 민감하고 구체적인 HCR 기술 덕분에 이 프로토콜을 진단 도구로도 사용할 수 있습니다. 또한 미래에 나타날 수 있는 비코딩 RNA 및 RNA 바이러스를 포함하여 임의의 RNA의 검출을 가능하게 하기 위하여 기술이 쉽게 수정될 수 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

본 원고에 기재된 면역-RNA-FISH 프로토콜은 베로 세포주 및 3D HAE 배양이라는 두 가지 세포 시스템을 사용하여 수행되었다. 두 셀룰러 모델의 주요 단계는 표 2에표시됩니다. HAE 배양에서 SARS-CoV-2의 시각화를 위한 RNA-FISH 프로토콜에는 조직 샘플, 즉 100% MeOH를 통한 투과성 및 0.1% Tween 솔루션을 통한 재수화를 위한 단계가 포함됩니다. 면역형광은 RNA-FISH가 완료된 ?...

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Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

여기서, 우리는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) RNA를 시각화하기 위하여 정시 혼성화 (RNA-FISH)와 면역형광에 있는 RNA 형광을 결합하는 간단한 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 단일 세포 수준에서 SARS-CoV-2 RNA 숙주 상호 작용의 분자 특성에 대한 이해를 증가시킬 수 있다.

시투 혼성화에서 면역 RNA-형광을 이용한 SARS-CoV-2의 시각화

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

visualization-sars-cov-2-using-immuno-rna-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

5.9K 조회수.  Jagiellonian University. 여기서, 우리는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) RNA를 시각화하기 위하여 정시 혼성화 (RNA-FISH)와 면역형광에 있는 RNA 형광을 결합하는 간단한 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 단일 세포 수준에서 SARS-CoV-2 RNA 숙주 상호 작용의 분자 특성에 대한 이해를 증가시킬 수 있다.

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Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

이종 교잡<em&gt; 현장에서</em&gt; 침샘, 난소, 그리고 벡터 모기의 태아의

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

연구

면역학 및 감염병학

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

형광성의<em&gt; 현장에서</em모기의 Mitotic의 염색체에&gt; 하이브리드

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

시투 혼성화에서 형광을 사용하여 뮤린 위장에서 칸디다 알비칸스의 시각화

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the presence of neutralizing antibodies against the virus may provide protection against future infection. Thus, as the creation and translation of effective COVID-19 vaccines continues at an unprecedented speed, the development of fast and effective methods to measure neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 will become increasingly important to determine long-term protection against infection for both previously infected and immunized individuals. This paper describes a high-throughput protocol using vesicular stomatitis virus (VSV) pseudotyped with the SARS-CoV-2 spike protein to measure the presence of neutralizing antibodies in convalescent serum from patients who have recently recovered from COVID-19. The use of a replicating pseudotyped virus eliminates the necessity for a containment level 3 facility required for SARS-CoV-2 handling, making this protocol accessible to virtually any containment level 2 lab. The use of a 96-well format allows for many samples to be run at the same time with a short turnaround time of 24 h.

The protocol described here outlines a fast and effective method for measuring neutralizing antibodies against the SARS-CoV-2 spike protein by evaluating the ability of convalescent serum samples to inhibit infection by an enhanced green fluorescent protein-labeled vesicular stomatitis virus pseudotyped with spike glycoprotein.

의사 바이러스 감염의 높은 처리량 형광 화상 진찰을 사용하여 SARS-CoV-2 중화 항체의 검출

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel pathogens, such as SARS-CoV-2. Multiplex serological testing can be particularly useful because it can simultaneously analyze antibodies to multiple antigens that optimizes pathogen coverage, and controls for variability in the organism and the individual host response. Here we describe a SARS-CoV-2 IgG 3-plex fluorescent microsphere-based assay that can detect both IgM and IgG antibodies to three major SARS-CoV-2 antigens-the spike (S) protein, spike angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2) receptor-binding domain (RBD), and nucleocapsid (Nc). The assay was shown to have comparable performance to a SARS-CoV-2 reference assay for IgG in serum obtained at &#8805;21 days from symptom onset but had higher sensitivity with samples collected at &#8804;5 days from symptom onset. Further, using soluble ACE2 in a neutralization assay format, inhibition of antibody binding was demonstrated for S and RBD.

A flow analysis system for bead-based multiplexed assays which provides a two-reporter readout was used for the development of multiplex serological and antibody neutralization assays that can simultaneously measure neutralizing IgG and IgM antibodies for SARS-CoV-2.

멀티플렉스 비드 기반 유량 분석 시스템을 위한 신속한 멀티플렉스 듀얼 리포터 IgG 및 IgM SARS-CoV-2 중화 분석

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). The increasing number of SARS-CoV-2 infections raises the need for better antibody detection assays. Current antibody detection methods compromise sensitivity for speed or are sensitive but time-consuming. A large proportion of SARS-CoV-2-neutralizing antibodies target the receptor-binding domain (RBD), one of the primary immunogenic compartments of SARS-CoV-2. We have recently designed and developed a highly sensitive, bioluminescent-tagged RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) to detect SARS-CoV-2 antibodies. The following text describes the procedure to produce the HiBiT-RBD complex and a fast assay to evaluate the presence of RBD-targeting antibodies using this tool. Due to the durability of the HiBiT-RBD protein product over a wide range of temperatures and the shorter experimental procedure that can be completed within 1 h, the protocol can be considered as a more efficient alternative to detect SARS-CoV-2 antibodies in patient serum samples.

The outlined protocol describes the procedure for producing the HiBiT-receptor-binding domain protein complex and its application for fast and sensitive detection of SARS-CoV-2 antibodies.

HiBiT 기반 바이오 리포터를 사용하여 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인 항체 검출

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota and the vertebrate gut. The spatial landscape of the gut microbiota is tightly controlled by physical features - intestinal mucus, crypts, and folds - and is affected by host-controlled properties such as pH, oxygen availability, and immune factors. These properties limit the ability of commensal microbes and pathogens alike to colonize the gut stably. At the micron-scale, microbial organization determines the close-range interactions between different microbes as well as the interactions between microbes and their host. These interactions then affect large-scale organ function and host health.
This protocol enables the visualization of the gut microbiota spatial organization from distances between cells to organ-wide scales. The method is based on fixing gut tissues while preserving intestinal structure and mucus properties. The fixed samples are then embedded, sectioned, and stained to highlight specific bacterial species through fluorescence in situ hybridization (FISH). Host features, such as mucus and host cell components, are labeled with fluorescently labeled lectins. Finally, the stained sections are imaged using a confocal microscope utilizing tile-scan imaging at high magnification to bridge the micron to centimeter length scales. This type of imaging can be applied to intestinal sections from animal models and biopsies from human tissues to determine the biogeography of the microbiota in the gut in health and disease.

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

This streamlined protocol details a workflow to detect and image bacteria in complex tissue samples, from fixing the tissue to staining microbes with fluorescent in situ hybridization.

시투 혼성화, 렉틴 염색 및 이미징에서 형광을 통한 장내 미생물군유립 상호 작용의 시각화

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has been responsible for over 242 million infections and more than 4.9 million deaths worldwide. Similar to other viruses, studying SARS-CoV-2 requires the use of experimental methods to detect the presence of virus in infected cells and/or in animal models. To overcome this limitation, we generated replication-competent recombinant (r)SARS-CoV-2 that expresses bioluminescent (nanoluciferase, Nluc) or fluorescent (Venus) proteins. These reporter-expressing rSARS-CoV-2 allow tracking viral infections in vitro and in vivo based on the expression of Nluc and Venus reporter genes. Here the study describes the use of rSARS-CoV-2/Nluc and rSARS-CoV-2/Venus to detect and track SARS-CoV-2 infection in the previously described K18 human angiotensin-converting enzyme 2 (hACE2) transgenic mouse model of infection using in vivo imaging systems (IVIS). This rSARS-CoV-2/Nluc and rSARS-CoV-2/Venus show rSARS-CoV-2/WT-like pathogenicity and viral replication in vivo. Importantly, Nluc and Venus expression allow us to directly track viral infections in vivo and ex vivo, in infected mice. These rSARS-CoV-2/Nluc and rSARS-CoV-2/Venus represent an excellent option to study the biology of SARS-CoV-2 in vivo, to understand viral infection and associated COVID-19 disease, and to identify effective prophylactic and/or therapeutic treatments to combat SARS-CoV-2 infection.

This protocol describes the dynamics of viral infections using luciferase- and fluorescence-expressing recombinant (r)SARS-CoV-2 and an in vivo imaging systems (IVIS) in K18 hACE2 transgenic mice to overcome the need of secondary approaches required to study SARS-CoV-2 infections in vivo.

리포터 발현 재조합 SARS-CoV-2를 이용한 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서의 바이러스 감염의 라이브 이미징 및 정량화

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by a high rate of transmission and low mortality, the COVID-19 pandemic necessitated accurate and efficient diagnostic testing, particularly in closed populations such as residential universities. Initial availability of nucleic acid testing, like nasopharyngeal swabs, was limited due to supply chain pressure which also delayed reporting of test results. Saliva-based reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) testing has shown to be comparable in sensitivity and specificity to other testing methods, and saliva collection is less physically invasive to participants. Consequently, we developed a multiplex RT-qPCR diagnostic assay for population surveillance of Clemson University and the surrounding community. The assay utilized open-source liquid handling robots and thermocyclers instead of complex clinical automation systems to optimize workflow and system flexibility. Automation of saliva-based RT-qPCR enables rapid and accurate detection of a wide range of viral RNA concentrations for both large- and small-scale testing demands. The average turnaround for the automated system was &#60; 9 h for 95% of samples and &#60; 24 h for 99% of samples. The cost for a single test was $2.80 when all reagents were purchased in bulk quantities.

The protocol describes a SARS-CoV-2 diagnostic method that utilizes open-source automation to perform RT-qPCR molecular testing of saliva samples. This scalable approach can be applied to clinical public health surveillance as well as to increase the capacity of smaller university laboratories.

오픈 소스 피펫팅 로봇을 활용한 효율적인 SARS-CoV-2 정량적 역전사효소 PCR 타액 진단 전략

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as microsporidia and viruses. Because of the similarities between Caenorhabditis elegans and mammalian intestinal cells, as well as the power of the C. elegans system, this host has emerged as a model system to study host intestine-microbe interactions in vivo. While it is possible to observe some aspects of these interactions with bright-field microscopy, it is difficult to accurately classify microbes and characterize the extent of colonization or infection without more precise tools. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used as a tool to identify and visualize microbes in nematodes from the wild or to experimentally characterize and quantify infection in nematodes infected with microbes in the lab. FISH probes, labeling the highly abundant small subunit ribosomal RNA, produce a bright signal for bacteria and microsporidian cells. Probes designed to target conserved regions of ribosomal RNA common to many species can detect a broad range of microbes, whereas targeting divergent regions of the ribosomal RNA is useful for narrower detection. Similarly, probes can be designed to label viral RNA. A protocol for RNA FISH staining with either paraformaldehyde (PFA) or acetone fixation is presented. PFA fixation is ideal for nematodes associated with bacteria, microsporidia, and viruses, whereas acetone fixation is necessary for the visualization of microsporida spores. Animals were first washed and fixed in paraformaldehyde or acetone. After fixation, FISH probes were incubated with samples to allow for the hybridization of probes to the desired target. The animals were again washed and then examined on microscope slides or using automated approaches. Overall, this FISH protocol enables detection, identification, and quantification of the microbes that inhabit the C. elegans intestine, including microbes for which there are no genetic tools available.

RNA Fluorescence in situ Hybridization FISH to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

Intestinal microbes, including extracellular bacteria and intracellular pathogens like the Orsay virus and microsporidia (fungi), are often associated with wild Caenorhabditis nematodes. This article presents a protocol for detecting and quantifying microbes that colonize and/or infect C. elegans nematodes, and for measuring pathogen load after controlled infections in the lab.

RNA 형광 제자리 혼성화(FISH)를 통해 Caenorhabditis elegans 장에서 미생물 집락화 및 감염을 시각화합니다.

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as ...