Lécuyer 실험실에서 실시 작품은 국립 과학 캐나다의 공학 협의회 (NSERC), 건강 연구 (CIHR)와 Fonds 드 공들인 실내 Santé 뒤 퀘벡 (FRSQ)의 캐나다 연구소에서 자금을 지원합니다. 캐롤 Iampietro는 안젤로 Pizzagalli 박사 교제를 지원하는 동안 파비오 알렉시스 Lefebvre와 게일 Moquin - Beaudry은 NSERC 학부 연구 studentships에 의해 지원됩니다.

1. RNA 프로브 준비 개요 : 다음 섹션은 물고기에 적합한 Digoxigenin (해봐)이라는 RNA 프로브를 만들기 위해 필요한 단계를 설명합니다. 첫 번째 단계는 복제 또는 시퀀스 특정 프로브를 생성하는 데 사용됩니다 관심있는 유전자의 베꼈 지역에 해당하는 순서를 증폭 PCR 포함됩니다. 이것은 여러 복제 사이트는 다음 발기인 시퀀스를 통합 측면을 노릴 프리 머를 사용하여 PCR을위한 템플릿으로 제공 할 수 박테리오파지 프로모터 요소 (T7, T3 또는 SP6)에 의해 둘러싸인되는 플라스미드에 처음 복제 유전자 세그먼트에 의해 달성 될 수있다 , 따라서 각각의 말단 (그림 1A)에서 다른 발기인 시퀀스와 선형 PCR 제품을 생성. : 또는 복제 단계를 방지하기 위해, 하나는 게놈 DNA 또는 cDNA T3 T7, 또는 5 &#39;극단에서 SP6 시퀀스 (예 : T7을 포함 oligonucleotides를 사용 PCR 증폭을 수행 할 수 있습니다5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 &#39;; T3 : 5&#39;-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3&#39;; SP6 : 5&#39;-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 &#39;). 선형 PCR 제품은 다음 실행 - 오프 적절한 효소 (그림 1B)와 체외 스크립트에 의해 해봐 - 라벨 감각이나 안티센스 RNA 프로브를 만들기 위해 템플릿으로 사용됩니다. 특정 유전자에 대한 프로브를 할 때, 우리는 생선 신호 특이성 (예 : 관심의 유전자가 안티센스 방향으로 베꼈하지 않는 한 평가에 도움이 될 것입니다 별개의 polymerases를 사용하여 감각 안티센스 RNA 프로브를 모두 준비하는 것이 좋습니다, 감각 RNA 프로브가 표시됩니다 배경 신호의 레벨). 다음 단계의 모든에서는, (예 : 물, 먼저 70 %의 에탄올 또는 상업적 RNAse의 오염 제거 솔루션으로 모든 벤치 공간과 장비를 청소하고 RNAse 무료 물자를 사용하여 오염 ribonucleases (RNAses)에 의해 잠재적 인 저하를 방지하기 위해 큰주의를 기울여야한다 팁, microcentrifuge 튜브). 엄마terials <ul><li> 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 (Abgene, 로체스터, NY, USA 고양이. 번호 0900) </li><li> 젤 - 추출 키트 (QIAGEN, Mississauga, ON, 캐나다,. 고양이 번호 28706). </li><li> RNAse 무료 물 (Wisent 주식회사 고양이. 번호 809-115-CL) </li><li> RNA의 polymerases (T3 T7, 또는 SP6). (20 U / μl, Fermentas Biosciences. 고양이. 번호 EP0101, EP0111, EP0131). </li><li> RNAse-OUT Ribonuclease 억제제 (40 U / μl), (Invitrogen, 버 링턴. Canada.Cat. 번호 10777-019 ON). </li><li> Digoxigenin (파) 염기 믹스 (파-11-UTP, 로슈 응용 Biosciences, 라발, QC, 캐나다. 고양이. No.11209256910). </li></ul> 장비 <ul><li> 테이블 상단 마이크로 원심 분리기 </li><li> 젤 - 전기 장치 </li></ul><ol><li> PCR은 게놈 DNA, cDNA, 또는 박테리오파지 T7, T3 또는 SP6 발기인 시퀀스으로 둘러싸인 선형 PCR 제품을 생성하는 플라스미드 DNA로부터 유전자 특정 순서를 증폭. PCR 조건에 대한 제조업체의 권장 사항을 따르십시오. </li><li> 품질과시 확인아가로 오스 겔 전기 영동하여 PCR 제품의 ZE. 추천을 생산하고 버퍼 50 μl에 제품을 elute에 따라 표준 젤 추출 키트를 사용 소비세 및 정화 PCR 제품입니다. </li><li> 3M의 아세트산 나트륨 (산도 5.2)과 얼음 차가운 100 % 에탄올 150 μl의 5 μl를 추가하여 PCR 제품을 침전하고, -70 ° C 하룻밤에 튜브를 놓습니다. 4 ° C에서 10 분 동안 13,000 XG에서 튜브를 원심 분리기와 70 %의 에탄올과 펠렛을 씻는다. 다시 돌려, 에탄올과 공기 펠렛을 건조의 모든 흔적을 제거합니다. RNAse 무료 물 25-50 μl에 Resuspend. </li><li> 10X T7 스크립트 버퍼 2 μl (Invitrogen), RNAse 억제제, 2 μl 해봐 - NTP 믹스 1 μl (20 U / μl) : 다음과 같이 20 μl 반응 200-500 NG 정화 PCR 제품을 사용 파 - 라벨 프로브를 고쳐 쓰다 , 2 μl T7 RNA 중합 효소의 (20 U / μl). RNAse 무료 물을 20 μl로 최종 볼륨을 가져와. 3-4 시간에 37 ° C에서 전사 반응을 품다. </li><li> transc을 조정RNAse 무료 물을 50 μl로 ription 믹스와는 4 단계에서 설명 해봐 - 라벨 RNA 프로브를 침전. RNAse 무료 물 100 μl에 씻은 RNA 펠렛을 Resuspend. -70 ° C.에 resuspended 샘플을 저장 </li><li> nanodrop 분광 광도계를 사용하여 프로브를 수량화. 프로브 품질을 확인하려면 ethidium 브로마이드와 1~2% 아가로 오스 겔 스테인드에 1-2 μl 샘플을 실행합니다. </li></ol> 2. Drosophila의 배아의 수집 및 고정 개요 :이 섹션은 무대 Drosophila의 배아를 수확 및 처리를 위해 단계를 설명합니다. 필요한 배아의 수에 따라 파리는 다양한 크기의 인구 케이지 유지 될 수 있습니다. 컬렉션은 100mm 사과 주스 수집 플레이트를 사용하여 900cm 3 원통형 새장을 사용하여 수행을위한 다음 단계는 다음과 같습니다. 적절한 고정은 배아를 둘러싼이 보호 층의 제거를 필요 바깥 쪽 융모막과 내부 vitellin전자 막 13. 일단 수확, 태아가 처음 융모막을 제거 할 수있는 50 % 표백제 용액에 목욕 있으며, 그때는 헵탄 (vitelline 막을 permeabilizes) 및 PBS는 3.7 %의 포름 알데히드를 포함하는를 포함하는 biphasic 솔루션에 혼합되어 있습니다. vitelline 막 나서 금과 헵탄과 메탄올의 biphasic 혼합으로 배아를 전송하여 제거됩니다. 적절한 배아 고정 및 vitelline 막 제거는 하류 물고기 절차의 성공을 위해 중요합니다. 자료 <ul><li> 사과 주스 허름한 크기의 효모 붙여 넣기와 한천 플레이트 (40 % 사과 주스, 4 %의 자당, 3.5 %의 한천, 0.3 % 메틸 paraben) (베이커의 효모는 버터의 일관성을 물과 혼합) </li><li> 가루 paraformaldehyde (전자 현미경 과학, 하트 필드, PA, USA,. 고양이 번호 19208) </li><li> 헵탄 </li><li> 메타놀 </li><li> 3 % 표백제 솔루션 </li><li> 20 ML 유리 병 섬광 (캐나다, ON 열 피셔 과학, 오타와,,. 고양이 번호 03-337-15). </li></ul> 장비 <ul><li> 인구 케이지 </li><li> 컬렉션 바구니 (Nitex 메쉬와 구멍이 뚜껑으로 잘라되었습니다 된 컷 50 ML의 폴리 프로필렌 튜브의 상단 부분을 사용하여 만든). </li><li> 작은 페인트 브러시 </li><li> 표 상단 소용돌이 </li></ul><ol><li> 25 1 시간을위한 신선한 사과 주스 / 효모 판으로 미리 명확 잘 자란 인구 케이지 ° C. </li><li> 초기 단계의 배아를 수확하기 위해 케이지에 새로운 사과 주스 / 효모 판을 추가합니다. 25 4 시간의 새장을 길​​러 ° C (수집 시간이 원하는 단계에 따라 조절 될 수 있다는주의). </li><li> 3.7 g의 paraformaldehyde 가루, 2N 코 70 μl, 그리고 화학 후드 아래에 유리 섬광 병에 milliQ 물 7.3 ML를 결합하여 새로운 37%의 포름 알데히드 용액을 준비한다. paraformaldehyde 분말이 완전히 용해 될 때까지 새로운 섬광 유리 병에 실내 온도와 필터 그리고 시원한 솔루션을 끓일. </li><li> 하여 biphasic 고정 솔루션을 준비다음 헵탄의 7.5 ML를 추가, 섬광 유리 병 37 %의 포름 알데히드 250 ML에 1X PBS의 2.25 ML을 결합. </li><li> 케이지에서 사과 주스 판을 수확하고 객실 온도 수돗물의 비트를 추가하고 섬세 페인트 브러시와 함께 접시에서 배아를 닦고하여 배아를 수집합니다. 바구니에 resuspended 배아를 전송하고 미지근한 수돗물로 씻어. </li><li> 표백제 용액에서 컬렉션 바구니를 수영 90 초 동안 Dechorionate 배아는 다음 미지근한 수돗물 (표백제 냄새가 사라질 때까지)로 철저하게 린스. </li><li> 수집 바구니를 분해, 부드럽게 붓을 사용하여 배아를 수집하고 biphasic 고정 솔루션으로도 양도 할 수 없습니다. 배아는 PBS와 헵탄 층 사이의 인터페이스에서 축적됩니다. </li><li> 인감 섬광 튜브와 와류 믹서에 고정. 가장 낮은 설정을 20 분 동안 흔들어. </li><li> 제거하고 파스퇴르 피펫을 사용하여 낮은 PBS와 상부 헵탄 단계의 대부분을 폐기합니다. 대기음피펫에 남아있는 PBS / 헵탄 / 배아 혼합물. dropwise 패션에서 배아를 제거하지 돌보는, 피펫에서 낮은 PBS 단계를 폐기하십시오. 500 μl 헵탄의 biphasic 솔루션 (상위 단계), 500 μl 메탄올 (낮은 단계)이있는 1.5 ML 튜브로 배아를 입금. </li><li> vitelline 세포막을 자극 30-45 초를 위해 손으로 힘차게 튜브를 흔들어. 일단 금이 간, 배아는 메탄올로 가라 앉을 것입니다. </li><li> 헵탄 / 메탄올의 계면에서 상단 헵탄 위상 및 uncracked 배아를 폐기하고, 메탄올 500 μl를 추가합니다. 5 초에 흔들어. </li><li> 메탄올로 3 회 씻고 -20 ° C (이 시점에서 배아는 주 / 개월 동안 저장 될 수있다)에있는 배아를 저장합니다. </li></ol> 3. 후 고정 처리, 하이브리드 및 사후 하이브리드 세차 개요 : 생선이 절 세부 배아 permeabilization에 대한 처리 단계 이전에, 사전 하이브리드,RNA 프로브 및 사후 하이브리드 세차와 하이브리드. 초기 permeabilization 단계의 경우 배아는 단일 관 (단계 아래 1-9, 정착 태아 / 샘플의 10-15 μl를 목표로)에 수영장으로 처리되지만, 그들은 96 - 웰 PCR 플레이트의 개인 우물에 aliquoted 아르 사전 하이브 리다이 제이션 단계 (아래 10 단계)로 진행하기 전에. 이 실험의 초기 단계에있는 모든 배아의도 치료를 보장하는 데 도움이됩니다. 물고기 실험을 설정하면 각각의 실험에서 배경 신호의 레벨을 결정하기 위해 부정적인 컨트롤을 포함하는 것이 중요합니다. 이를 위해, 우리는 섹션 1, 일반적으로 &#39;노 프로브&#39;조건에 필적하는 신호를 제공합니다 &#39;의미&#39;RNA 프로브와 hybridized 샘플에 명시된 바와 같이 &#39;노 프로브&#39;샘플을 포함시키는 것이 좋습니다합니다. 자료 : <ul><li> 메타놀 </li><li> 인산염은 0.1 % 십대 초반 - 2​​0 (PBT)와 염분 버퍼 </li><li> Proteinase-K 1 MG / ML 주식 솔루션 (시그마 알드리치, 옥빌, ON, 캐나다. 카탈로그 번호 P2308) </li><li> 글리신 (20 MG / ML 주식 솔루션) </li><li> 하이브리드 솔루션 : 50 % 포름 아미드, 5 배 SSC, 0.1 % 십대 초반 - 2​​0 빠졌어 연어 정자 DNA의 100 G / ML, 100 μg / ML 헤파린. </li><li> 0.2 ML 96 - 잘 PCR 플레이트, Abgene, 로체스터, NY, USA 고양이를 halfskirted. 0900 없음) 없음 </li></ul> 장비 <ul><li> 56 조정 하이브 리다이 제이션 오븐, 디지털 가열 블록이나 물 목욕 ° C, 80 ° C 또는 100 ° C, 또는 PCR 기계. </li><li> 멀티 채널 pipettors (세정 단계를 단순화하는 것이 좋습니다) </li><li> 믹서를 Nutating </li></ul><ol><li> PBT에 두 번 한 후 PBT, 그리고 : 메탄올의 1:1 혼합물에 다음 메탄올에 배아를 씻어. </li><li> PBT는 nutator에 일정한 흔들와 3.7 %의 포름 알데히드를 (11 단계에 설명 된대로 신선하게 조리 된) 포함 1 ML의 20 분의 배아를 해결했습니다. </li><li> PBT에서 2 분 흔들면서 3 번 배아를 씻으십시오. </li><li> 3 μg / PBT에 희석 proteinase K (PK)의 ML의 솔루션을 준비하고 추가샘플에 대한 솔루션 500 μl. 흔들림없이 실내 온도에서 10 분에 샘플을 품다. 피펫으로 분사하거나 부드럽게 반전 튜브의 배아마다 2 분을 섞는다. </li><li> 1 시간에 얼음 배아 샘플을 전송합니다. </li><li> 실내 온도에 샘플을 이동 PK 솔루션을 제거합니다. PBT + 2 밀리그램 / ML 글리신의 1 ML과 2 분에 2 번 씻으십시오. </li><li> 요동와 PBT + 3.7 %의 포름 알데히드의 1 ML에 샘플 20 분 문제를 해결했습니다. 태아에게 PBT 5 번 씻어. </li><li> PBT 및 Hyb 솔루션의 1:1 혼합물의 1 ML과 배아를 씻어. 백퍼센트 Hyb 솔루션 (이 단계에서 배아는 -20 ° C에서 몇 일 / 주 동안 저장 될 수 있습니다)의 0.5-1 ML로 대체합니다. </li><li> 96 - 웰 플레이트 (/ 잘 배아 손상을 방지하기 위해 폭 넓은 조리개 팁을 사용하는데주의를 기울여야 해결 배아의 ~ 10-15 μl를위한 목표)의 각 우물에 나누어지는의 배아. </li><li> 5 분을위한 얼음에 시원 후 5 분에 있고 Hyb 솔루션 100 μl / 샘플을 끓일. 이 솔루션은 (사전 Hyb) 샘플 사전 하이브 리다이 제이션에 사용됩니다. </li><li> 사전 Hyb 솔루션 100 μl / 샘플을 추가하고 56에서 최소한 2 시간에 품다 ° C. </li><li> 각 샘플을 보려면 Hyb 솔루션 100 μl에 프로브의 ~ 100 NG를 희석. 80 예선 5 분 (온수 프로브는 몇 시간 동안 얼음에 보관하실 수 있습니다)에 얼음 이후 쿨 3 분에 대한 ° C. </li><li> 배아에서 사전 Hyb 솔루션을 제거하고 RNA 프로브 솔루션으로 교체하십시오. </li><li> 12-16 시간에 56 ° C에서 잡종을 만들다. </li><li> 56에서 사전 따뜻하고 다음 세척 솔루션 ° C : (A) 200 Hyb 솔루션의 μl / 샘플 (B) Hyb의 3시 1분 혼합의 100 μl / 샘플 : PBT,의 (C) 100 μl / 샘플 Hyb의 1시 1분 혼합 : PBT, (D) Hyb의 1시 3분 혼합의 100 μl / 샘플 : PBT (E) PBT 400 μl / 샘플. </li><li> 세탁 솔루션 100 μl와 함께 샘플을 씻어 후 15 분마다 56의 솔루션 AD 100 μl / 샘플과 세척 단계 ° C를 수행합니다. 그런 다음, 56 ° C.에서 솔루션 E의 100 μl / 샘플 5 분에 샘플 4 번 씻어 </li><li> 실내 온도에 차가운 샘플. </li></ol> 개요 :이 섹션은 RNA 프로브 신호 다음 하이브 리다이 제이션의 분포를 감지하고 시각화하는 데 사용되는 항체를 검출 시약을 설명합니다. 이 단계는 그림 2에 개략적으로 설명되어 있습니다. 여기 우리는 강력한 신호 증폭에 사용하는 표준 검출 시약 만 제시하지만, 단백질 RNA 두 번에 동시에 서로 다른 RNAs를 공동 감지 두 번 생선 실험을 수행 할 때 특히 다양한 대안으로 사용할 수 있습니다 상업적으로 이용 가능한 시약을 존재 착색. 이 프로토콜로 얻어진 결과의 예는 그림 3의 mRNA 표현 / 현지화 패턴 모자이크에 표시됩니다. 자료 <ul><li> HRP-복합 마우스 단클론 항 파 (잭슨 ImmunoResearch 연구소 주식회사 고양이. 번호 200-032-156) </li><li> 비오틴 - 복합 마우스 단클론 항 파 (잭슨 ImmunoResearch 연구소 주식회사 고양이. 번호 200-062-156) </li><li> Streptavidin-HRP 공액 (분자 프로브, 유진 OR, USA, 고양이. No.S991) </li><li> Cy3-tyramide의 conjugates (Perkin 엘머 생명 과학, 보스톤, MA, 미국, 고양이. 번호 SAT704A) </li><li> DABCO이 솔루션을 설치 : 50 ML 튜브에 DABCO의 1.25 g 희석 (1,4-diazabicyclo [2.2.2] 옥탄을, 시그마 D-2522) 완전 할 때까지 1X PBS의 15 ML에 한 다음 35 글리세롤의 ML와 혼합을 추가 균질. PBS로 premixing으로 DABCO 분말은 매우 신속하게 용해된다. -20 ° C.에 상점 장착 솔루션 </li><li> 유리 슬라이드, coverslips </li></ul> 장비 <ul><li> 믹서를 Nutating </li><li> 멀티 채널 pipettor </li><li> 형광 현미경 </li></ul><ol><li> PBT를 포함하는 PBTB 솔루션 + 1 % 비 지방 건조 우유를 (보통 50-100 ML 모든 검색 시약 보육 및 세정 단계 충분합니다) 준비합니다. </li><li> nutator에 흔들하면서 100 μl PBTB / 샘플의 온도는 실온에서 10 분 동안 샘플을 차단합니다. </li> &lt;리&gt; 락 100 μl / 샘플 단클론 비오틴 안티 - 파 항체 솔루션 (PBTB에 혈통이 4백분의 1을 희석)로 실온에서 1.5-2 시간에 태아 및 배양 샘플에서 차단 솔루션을 제거합니다. </li><li> 각 흔들 100 μl PBTB / 샘플 5 분에 샘플 6 번 씻으십시오. </li><li> 락과 streptavidin-HRP 솔루션 (PBTB, 10 μg / ML 최종 농도 혈통 1백분의 1을 희석)의 75 ML / 샘플 실온에서 1.5 시간을 품다. </li><li> 샘플 씻어 5 분 6 번 흔들어 (DNA의 counterstaining에 대해 PBTB의 1X 작업 농도에 DAPI를 희석하고 첫 번째 세척 단계에서이 솔루션을 사용) 100 μl PBTB / 샘플.을 </li><li> PBT와 배아를 씻어 후 PBS로 5 분을 위해 2 번을 씻는다. </li><li> Cy3-tyramide 솔루션 (Tyramide 증폭 버퍼에 50분의 1 희석)의 50 μl / 샘플과 nutator에 실온에서 2 시간 동안 샘플을 품다. 에서이 단계에서, 밝은 차폐 소켓에 샘플을 보관해야합니다. &lt;이/ 리&gt; <li> 5 분마다 nutator에 100 μl PBS / 샘플과에 샘플 6 번 씻으십시오. </li><li> PBS를 제거하고 70 % 글리세롤 및 2.5 % (DABCO)를 포함 장착 솔루션의 100-125 μl / 샘플을 추가 할 수 있습니다. 스토어 샘플 4에 ° C. 이 샘플은 몇 년 동안 저장 될 수 있습니다. </li><li> 넓은 보어 팁을 사용하여 부드럽게 샘플을 pipetting하여 배아를 resuspend과 유리 슬라이드로 배아의 25 μl를 전송 한 후 손톱 폴란드어와 슬라이드로 배아 및 인감 이상 coverslip를 놓습니다. </li><li> 형광 현미경을 사용하여 배아 샘플을 분석합니다. </li></ol>

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	<li>Wilcox, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+principles+of+in+situ+hybridization.">Fundamental principles of in situ hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li><li>Lecuyer, E., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+gene+expression+universe.">Mapping the gene expression universe.</a> Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).</li><li>Tomancak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+patterns+of+gene+expression+during+Drosophila+embryogenesis.">Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis.</a> Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).</li><li>Thisse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+expression+of+the+zebrafish+genome+by+large-scale+in+situ+hybridization+screening.">Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening.</a> Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).</li><li>Quiring, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization.">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li><li>Pollet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+differential+gene+expression+during+early+Xenopus+embryogenesis.">An atlas of differential gene expression during early Xenopus embryogenesis.</a> Mech. Dev. 122, 365-439 (2005).</li><li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain.">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445, 168-176 (2007).</li><li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li><li>Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+blueprint+for+a+chordate+embryo.">Regulatory blueprint for a chordate embryo.</a> Science. 312, 1183-1187 (2006).</li><li>Bell, G. W., Yatskievych, T. A., Antin, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEISHA,+a+whole-mount+in+situ+hybridization+gene+expression+screen+in+chicken+embryos.">GEISHA, a whole-mount in situ hybridization gene expression screen in chicken embryos.</a> Dev. Dyn. 229, 677-687 (2004).</li><li>Wilkie, G. S., Shermoen, A. W., O'Farrell, P. H., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcribed+genes+are+localized+according+to+chromosomal+position+within+polarized+Drosophila+embryonic+nuclei.">Transcribed genes are localized according to chromosomal position within polarized Drosophila embryonic nuclei.</a> Curr. Biol. 9, 1263-1266 (1999).</li><li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+embryo+dechorionation.">Drosophila embryo dechorionation.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Stapleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+gene+collection:+identification+of+putative+full-length+cDNAs+for+70%+of+D.+melanogaster+genes.">The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes.</a> Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).</li><li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+complementary+DNA+resource.">A Drosophila complementary DNA resource.</a> Science. 287, 2222-2224 (2000).</li><li>Tomancak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+determination+of+patterns+of+gene+expression+during+Drosophila+embryogenesis.">Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis.</a> Genome Biol. 3, (2002).</li><li>Terashima, J., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+available+food+into+the+number+of+eggs+laid+by+Drosophila+melanogaster.">Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167, 1711-1719 (2004).</li><li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues.">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).</li><li>Lecuyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+in+Drosophila.">High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila.</a> Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).</li><li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846 (2004).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

프로브 합성 단계의 경우, 우리는 일반적으로 Drosophila 유전자 컬렉션 (DGC), 다음 웹 사이트에서 설명하는 자원에서 발견 plasmids의 증폭 전체 길이 Drosophila의 cDNAs에서 체외 스크립트에 의해 실행 - 오프 안티센스 RNA 프로브를 생성 : <a href="http://www.fruitfly.org/DGC/index.html" target="_blank">http://www .fruitfly.org / DGC / index.html 페이지</a> 14,15. 이 접근 방식은 플라이 배아 9,16의</su...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> T7, T3 또는 SP6 RNA 중합 효소의 </td><td> Fermentas 생명 과학 </td><td> EP0101, EP0111, EP0131 </td><td> 키트는 반응 버퍼가 포함되어 있습니다. </td></tr><tr><td> 파 RNA 라벨 믹스 </td><td> 로슈 응용 과학 </td><td> 11 277 073 910 </td><td></td></tr><tr><td> RNAguard </td><td> Amersham Biosciences </td><td> 27-0816-01 </td><td></td></tr><tr><td> 3M의 아세트산 나트륨 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 차가운 100 % 에탄올. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 차가운 70 % 에탄올. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 염소 표백제 솔루션은 물과 1:1 희석. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 헵탄 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 메타놀 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> proteinase K </td><td> 시그마 알드리치 옥빌, ON, 캐나다 </td><td> 카탈로그 번호 P2308 </td><td></td></tr><tr><td> 40 % 포름 알데히드 용액, 신선한 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS-십대 초반 솔루션 (PBT) </td><td></td><td> 1xPBS, 0.1 % 십대 초반-20 </td><td></td></tr><tr><td> 글리신 솔루션 </td><td></td><td> PBT에서 2 밀리그램 / ML 글리신 </td><td></td></tr><tr><td> 단클론 HRP-복합 마우스 안티 - 파 </td><td> 잭슨 ImmunoResearch 연구소 주식회사 </td><td> 200-032 - 156 </td><td> (PBTB의 1 MG / ML 주식 솔루션의 400분의 1 희석 </td></tr><tr><td> HRP-복합 양 안티 - 파 단클론 </td><td> 로슈 응용 ScienCE, 라발, QC </td><td> 1 207 733 </td><td> PBTB의 주식 솔루션의 5백분의 1 희석 </td></tr><tr><td> 비오틴 - 복합 마우스 단클론 항 파 </td><td> 잭슨 ImmunoResearch 연구소 주식회사, 웨스트 그 로브, PA, USA </td><td> 200-062-156 </td><td> (PBTB의 1 MG / ML 주식 솔루션의 400분의 1 희석 </td></tr><tr><td> Streptavidin-HRP 공액 </td><td> 분자 프로브, 유진 OR, USA </td><td> S991 </td><td> (1 μg / ML 주식 100분의 1 희석 </td></tr></tbody></table>

whole mount rna fluorescent in situ hybridization of drosophila embryos

유전자뿐만 아니라 베꼈 RNA의 subcellular 지방화 속성의 표현 패턴을 평가하는 것은 개발 과정의 생물학적 기능을 이해하기위한 핵심 기능입니다. 현장 하이브리드 화의 RNA (RNA 살쯤)는 RNA 배포 속성을 시각화하는 데 사용되는 강력한 방법입니다, organismal, 휴대 또는 subcellular 레벨 1에서합니다. RNA 살쯤는 mRNA 또는 관심 (2)의 비 코딩 RNA 대상의 순서를 보완이라는 핵산 산 프로브 (예 : 안티센스 RNA, oligonucleotides)의 하이브리드에 기반을두고 있습니다. 프로 시저가 순서 특정 프로브를 생성 할 만 기본 순서 정보를 필요에 따라, 그것은 보편적 생물과 조직 표본 3의 광범위한 적용 할 수 있습니다. 사실, 대규모 틱 연구 번호가 유전자 발현을 문서화하고 다양한 모델 생물에서 현지화 역학을 RNA하기 위해 구현되었으며, 이는하게되었다중요 지역 사회 자원 4-11의 설립. 프로브 라벨 및 검색 전략의 다양한이 년 동안 개발 된 반면, 휘황-라벨 감지 시약 및 효소 신호 증폭 단계의 결합 사용은 절차 12 감도와 해상도에 상당한 향상을 제공합니다. 여기, 우리는 무대 Drosophila의 배아에서 RNA의 발현 및 현지화 역학을 시각화하는 tyramide 신호 증폭 (TSA)을 채용 원위치 하이브리드 화 방법 (물고기)에 최적화 된 형광을 설명합니다. 절차는 크게 샘플을 다수의 동시 처리를 용이하게 96도 PCR 플레이트 형식으로 수행됩니다.

성공적으로 수행되면,이 절차는 초기 Drosophila의 embryogenesis 동안 유전자 발현 및 mRNA의 현지화 역학의 spatio - 시간적 분석의 상세 놀랍도록 향상된 수준을 제공합니다. 클래식 쌍 - 규칙 유전자 꼬마 (실행)를도 3a에 도시 된 바와 같이 실제로, 하나는 핵을 표현 그룹의 초기 스크립트 foci의 검출을 통해 유전자 발현 이벤트를 관찰 할이 프로토콜을 사용할 수 있습니?...

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Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

여기 우리는 전체 마운트 형광을 설명<em&gt; 현장에서</em과일 플라이의 embryogenesis 동안 표현 RNAs의 표현 및 현지화 특성을 결정하기위한&gt; 하이브리드 (물고기) 프로토콜,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

whole-mount-rna-fluorescent-situ-hybridization-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

18.2K 조회수.  Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM). 여기 우리는 전체 마운트 형광을 설명 현장에서 하이브리드 (물고기) 프로토콜, Drosophila melanogaster.

비디오: Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

전체 마운트를 사용하여 현장에서</em분자 생물학과 Organismal를 링크> 하이브 리다이 제이션

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

전체 산<em&gt; 현장에서</emE11.5 마우스 태아에 E8.5의&gt; 하이브리드

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNA 형광하여 단일 세포 유전자 전사의 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 (물고기)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

형광등과 결합 염색체 복제 타이밍<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; 현장에서</em전체 마운트 태아 및 세포 조직학에서&gt; 하이브리드는 해양 Elasmobranchs을위한 적응

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

높은 해상도 전체 마운트<em&gt; 제자리에서</em유전자 발현 및 기능을 연구하는 제브라 피쉬 배아에서&gt; 하이브리드

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...