이 기술은 내부 chorda tympani 맛 경로의 중요한 부분인 조닐컬트 신경리아의 맛에 대한 신경 반응에 대한 중요한 기능적 질문에 대답할 수 있습니다. 이 기술은 동물당 기록된 세포가 전형적으로 전기생리학적 방법을 통해 관찰되는 것보다 훨씬 높기 때문에 단일 실험 시험에서 다중 개별 뉴런의 실시간 반응을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 가열 패드의 척추 위치에 헤드 포스트 장착 마우스를 사용하면 흉골에서 턱까지 목 구멍 위에 피부에 2 센티미터 중간 개목을 만듭니다.
그리고 피부와 상악샘을 완전히 노출시키기 위해 피부와 상악샘을 철회합니다. 파라트라세이머 의 솔기를 분리한 후, 솔기를 무딘 해부로 분리하고 조직을 철회하여 열게 한다. 기관지의 직경을 반이상 절단하지 않고 폴리에틸렌 튜브의 조각을 맞출 수있을만큼 큰 기관의 상단에 구멍을 신중하게 잘라 폐를 향해 기관체에 튜브를 삽입합니다.
리트랙터를 재배치하여 분리된 근육을 방출하고 상악선 이하의 땀샘을 후퇴시킵니다. 그런 다음 소량의 수의 접착제를 사용하여 튜브 위에 함께 paratracheal 근육을 밀봉하십시오. 고리패닉 불라를 열어 놓기 위해 원하는 디거스트릭 근육을 부드럽게 애타게 하고 결합 조직을 분리합니다.
혈관을 피하고 근육의 앞쪽 끝에서 절개를하십시오. 그리고 정폭 황소가 지울 때까지 뒤로 당깁니다. 머리를 약간 뒤로 기울여 고리관절을 들어 올리고 경동맥 전방의 가지를 디거스근육의 후방 삽입 지점으로 찾습니다.
팔파테는 정사각형 황소의 볼록한 구조를 위해 이 혈관을 후방으로 만들고 근육에 솔기를 찾습니다. 두 세트의 미세 한 집게를 사용하여, 타일라패닉 불라의 뼈가 보일 때까지 솔기에서 무딘 해부하고 골격의 명확한 보기를 유지하기 위해 방망기를 사용합니다. 황소의 후방에 전방을 달리는 솔기를 찾아 외과 프로브를 사용하여 솔기의 중앙에 뼈에 구멍을 찌른 다음 미세 한 끝 가위를 사용하여 뼈의 원형 영역을 잘라내고 혈관을 앞쪽과 후방을 황소 또는 아래에 자르지 않도록주의하십시오.
천재를 노출하려면 달팽이관을 찾습니다. 달팽이관에 전방은 텐서 티파니 근육입니다. 스프링 가위를 사용하여 이 근육을 자르고 제거하십시오.
외과 프로브를 사용하여 달팽이관 포동에 구멍을 뚫고 즉시 흡입을 사용하여 구멍에서 흐르는 액체를 흡입하십시오. 달팽이관의 구멍을 확대하여 달팽이관에 둘러싸인 혈관을 손상시키지 않도록 주의하여 후방 및 측면 가장자리로 확대합니다. 그리고 마우스의 머리를 앞으로 기울여 이전 달팽이관 구조 아래에 측두골의 구멍을 찾습니다.
일곱 번째 신경 위에 직접 앉아 구멍에 능선 전방의 주의하십시오. 그리고 일곱 번째 신경을 노출하기 위해 현세골이 조심스럽게 들어 올릴 수 있도록 구멍에 수술 프로브를 삽입합니다. 조료가 완전히 보이지 않으면 동물의 머리를 부드럽게 뒤로 기울여 뼈 앞쪽을 신경에 끌어 올리십시오.
신경리아가 여전히 가려지면, 뼈 아래에 프로브를 배치하지 않도록주의, 아래에서 더 많은 뼈를 당겨, 이 geniculate을 손상 시킬 수 있습니다. 술판을 실행하려면 흡입을 사용하여 조폐물 위로 액체를 제거하고 해부 현미경 아래에 흡수 패드에 마우스를 놓습니다. 황소에 남아있는 구멍, 측두골뼈의 구멍, 일곱 번째 신경을 사용하여 조랑말 신경절을 찾습니다.
그리고 피광성 범위에 FITCGFP 필터를 사용하여 조닐레이트 신경절 뉴런을 발현하는 개별 GCaMP를 확인한다. 디스펜싱 바늘을 한 번의 타질 라인에 단단히 놓고 페트리 접시를 입 아래에 놓고 액체를 잡습니다. 녹화 시 응답, 드리프트 및 seepage에 대한 실시간 피드를 보고, 녹화 시작과 함께 비디오 녹화의 시작을 동기화합니다.
시페이지가 발생하면, 조니큐레이트의 시야가 명확해질 때까지 액체를 흡입하고 술물을 다시 전달한다. 드리프트가 발생하면 헤드포스트의 모든 부분이 단단히 조여있는지 확인합니다. 응답이 발생하지 않으면 액체가 흐르고 현미경과 카메라가 시야를 가리는 것이 없는 적절한 위치에 초점을 맞추고 있는지 확인하십시오.
원하는 모든 실험이 완료되면, 부드럽게 re트랙터를 완화하고 동물의 반대편에 노출 및 맛 분석을 반복합니다. 관찰된 바와 같이, 혀에 적용된 맛 자극은 GCaMP 형광의 급격한 일시적인 증가를 초래하여 반응하는 뉴런 들 사이에서 밝기의 눈에 띄는 변화를 야기해야 합니다. 형광 비디오 푸티지를 분석하면 시간이 지남에 따라 관심 있는 개별 영역 내에서 기준 응답에 대한 형광 변화에 대응하는 추적을 생성할 수 있습니다.
임계값 수준 이상의 형광 강도의 변화는 긍정적인 반응으로 간주됩니다. 간경을 손상시키는 것 외에도 출혈을 피하는 것이 중요합니다. 출혈이 발생하면, 혈액이 혈전을 기다렸다가 식염수와 흡입을 적용하여 시야에서 혈액을 제거하십시오.
조니쿨레이트 신경리아의 시각화는 연구원이 직접 맛과 같은 자극에 뉴런의 반응을 측정하고 Cre-의존하는 GCaMP와 같은 도구로 이러한 뉴런을 식별 할 수 있었습니다.
