본 연구는 침술 자극에 대한 신경 DRG의 뉴런 반응을 조절하는 한편, 침술의 진통 효과를 내부 통증에 미치는 진통 효과를 설명하는 데 관여하는 체성 감각 시스템의 뉴런 및 회로에 중점을 두고 있습니다. 전기 기록과 같은 전통적인 방법은 생체 내에서 내장 또는 체세포 반응 뉴런을 식별하기 위해 충분한 세포 수와 뚜렷한 특정 세포 관계를 효율적으로 검사할 수 없습니다. 침술의 진통 효과에서 DRG 뉴런의 기능적 역할을 연구하는 것은 기술적 제약으로 인해 어려웠습니다.
우리는 in vivo에서 결장 내 및 침술 시뮬레이션에 대한 6번 DRG 뉴런의 역할을 관찰하기 위한 일반적인 접근 방식을 도입했습니다. 이 프로토콜은 체세포 및 내장 입력에 대한 반응으로 생체 내에서 DRG 뉴런의 활동을 관찰하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이는 체세포 자극 하에서 L5 DRG의 뉴런 반응을 조사하는 데에만 초점을 맞췄던 이전 연구에서 개선된 것입니다.
미래에는 올바른 설정을 통해 DRG in vivo CAS 이미징을 흉부 또는 경추 분절에서 수행할 수 있으며, 이는 내장 통각 및 침술 효과를 연구할 수 있는 보다 강력한 도구를 제공할 수 있습니다. 이 방법은 침술 연구자들이 배우는 데 필수적입니다. 시작하려면 기관 절개식 마우스를 가열 패드의 엎드린 위치에 놓습니다.
허리 아래쪽을 7cm 길이의 정중선 절개를 만들고 5번째 요추에서 첫 번째 천추까지 연장합니다. 그런 다음 롱기시무스 요추 근육을 조심스럽게 옆으로 움직여 세 척추의 가시돌기를 드러냅니다. 양측 요추 종근, 등쪽 요추 근육 및 등쪽 요추 반척추 근육의 내부 부분을 이동하여 척추 중앙의 기록 분절과 함께 연속적인 3개의 관절 및 유방 돌기를 노출시킵니다.
이제 이웃 척추의 양측 관절 돌기에 이빨 집게로 동물을 단단히 고정시킵니다. 롱거 겸자를 사용하여 요추 4개 또는 6개의 척추의 왼쪽 또는 오른쪽 관절 및 유방 돌기를 제거합니다. 왼쪽 또는 오른쪽 요추 위의 결합 조직을 제거한 후 6 DRG를 조심스럽게 노출시킵니다.
요추 6척추의 선택한 쪽에서 상영관이 손상되지 않도록 합니다. 노출된 DRG 부위를 식염수에 적신 작은 면봉으로 덮어 활성 상태를 유지합니다. 이제 저유량 마취 전달 시스템을 기관 캐뉼라에 연결하여 마우스에 삽관을 합니다.
DRG가 노출된 동물을 맞춤형 척추 클램프 단계에 위치한 발열 패드에 놓습니다. 이웃 척추의 척추에 두 개의 클램프를 사용하여 동물을 고정하여 테스트 중 움직임을 최소화합니다. 그런 다음 수술 부위가 충분히 깨끗해질 때까지 식염수에 적신 면봉을 교체하십시오.
맞춤형 척추 클램프를 맞춤형으로 설계된 현미경 스테이지에 삽입합니다. 이미징을 위해 컨포칼 현미경의 긴 작동 거리 공기 대물 렌즈를 노출된 DRG 위에 배치합니다. 스텝당 25마이크로미터, 512 x 512 또는 1, 024 x 1, 024 픽셀 해상도로 온전한 요추 4개 또는 6개 DRG의 타임랩스 Z 스택을 캡처할 수 있습니다.
1-3개의 기준선 상태, 2-3개의 침술 또는 내장 결장 직장 팽창 자극, 1-2개의 자극 후 상태를 포함하는 4-8개의 스택으로 DRG의 XYZT 스캔을 수행합니다. 그런 다음 동물의 허리, 뒷다리 또는 뒷발에 빗질 또는 꼬집기 자극을 가하여 이미지화된 DRG 뉴런의 가장 민감한 수용 영역을 평가합니다. 침술 자극을 수동으로 투여하거나 시중에서 판매되는 경혈 및 신경 자극기를 사용하여 투여합니다.
내장 자극을 유도하기 위해 자체 제작 된 공기압 게이지로 결장 직장 팽창을 사용하십시오. 컨포칼 현미경을 사용하여 체세포 또는 내장 자극에 따라 세포 내 칼슘에 결합할 때 신경 세포 GCaMP의 녹색 형광 증가를 측정합니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 색상 옵션을 사용하여 비디오를 밝게 합니다.
보이는 세포를 수동으로 묘사하고 세포 크기와 상대적인 형광 강도를 확인합니다. 형광 강도를 기저 수준에 대한 최대 유발 형광의 증가의 비율로 표현합니다. 요추 6개 DRG 뉴런은 일반적으로 기준선 GFP 형광이 부족하며, 이는 GCaMP 발현 수준 및 외과적 손상의 영향을 받을 수 있습니다.
대장직장 팽창 자극은 GCaMP 형광의 급격하고 일시적인 증가를 유도했습니다. BL25 전기침술에서도 유사한 반응이 관찰되었다. 히트맵과 라인 차트는 결장직장 팽창과 BL25 전기 침술에 대한 모든 원형 뉴런의 반응을 보여주었습니다.
히스토그램은 결장직장 팽창과 BL25 전기 침술에 반응하는 뉴런의 직경을 보여줍니다.
