당사의 프로토콜은 생체 재료로 사용하기 위해 폴리머 나노 입자 하이드로겔의 제형을 용이하게합니다. 우리는 연구원이 번역 응용 프로그램을 위해이 자료를 개발하고 기본적인 생물학적 질문을 탐구할 수 있기를 바랍니다. PNP 하이드로겔은 작은 직경의 바늘과 카테터를 통해 쉽게 주입되지만 주입 후 신속하게 자가 치유됩니다.
이것은 오랜 기간 동안 약물과 세포의 비 침습적 제어 전달을 허용합니다. 이 기술은 국소화된 치료 및 확장된 약 방출을 위한 경계를 밀어내고, 암에서 조직 재생에 수동적인 예방 접종에 이르는 광범위한 격렬한 조건에 대한 의미와 함께. 나노 강수량에 의해 나노 입자를 합성하려면 8 밀리리터 유리 신자극 바이알에 50 밀리그램의 PEG-PLA 폴리머를 추가하고 유리에 아세토나이트 1 밀리리터를 추가합니다.
소용돌이가 완전히 녹습니다. 다음으로 10밀리리터의 초순수수를 작은 교반바가 있는 20밀리리터 유리 신자극 바이알에 넣고, 분당 600회전으로 설정된 스티어 플레이트에 바이알을 놓습니다. 200 마이크로리터 파이펫을 사용하여 폴리머 용매 용액 1밀리리터를 물 바이알에 드롭방향으로 추가합니다.
코어 쉘 나노 입자는 폴리머 용매 용액이 물 전체에 급속하게 분산됨에 따라 형성됩니다. 표준 프로토콜에 따라 동적 광 산란하여 파티클 크기를 확인합니다. 그런 다음 나노 입자 용액을 원심 필터 장치로 이송하여 용액을 250 마이크로리터 미만으로 농축하고 적절한 버퍼로 나노 입자를 재연합니다.
하이드로겔을 준비하려면 333밀리그램의 6%HPMC-C12 스톡 솔루션을 1밀리리터 루어 잠금 주사기에 추가하고 20%나노입자 스톡 솔루션의 500마이크로리터와 8밀리리터 바이알에 PBS 167 마이크로리터를 추가합니다. 혼합 후 바늘을 사용하여 희석 된 나노 입자 용액으로 다른 1 밀리리터 루어 잠금 주사기를 채우고 두 주사기를 팔꿈치 믹서에 부착하십시오. 균일하고 불투명한 백색 하이드로겔 소재가 형성될 때까지 약 60사이클동안 두 가지 솔루션을 혼합합니다.
제조된 하이드로겔의 유변학적 특성을 측정하기 위해, 엄선된 형상 갭에 따라 하이드로겔의 적절한 부피를 톱니모양 류미터 플레이트의 중심으로 주입하고 진동 및 유량 테스트를 사용하여 시료의 기계적 특성을 측정한다. 하이드로겔에서 약물 방출을 특성화하기 위해 먼저 에폭시를 사용하여 각 튜브의 한쪽 끝을 밀봉하여 유리 모세 혈관을 준비합니다. 에폭시가 설정되면 4인치 22게이지 피하 바늘을 사용하여 100~200마이크로리터의 하이드로겔을 샘플당 최소 3개의 튜브에 주입하고, 각 하이드로겔 부피에 200~300마이크로리터를 조심스럽게 추가합니다.
적절한 시점에서, 약물 방출의 예상 된 기간에 따라, 조심스럽게 하이드로겔 표면을 방해하지 않고 각 모세관에서 PBS를 제거하고 PBS의 신선한 볼륨을 추가하는 바늘을 사용합니다. 연구가 완료되면 수집된 PBS 알리쿼트를 적절한 방법으로 분석하여 각 시점에서 방출되는 약물의 양을 정량화한다. 겔 캡슐화된 인슐린의 열 안정성을 특성화하기 위해 인슐린과 티오플라빈 T를 하이드로겔에 적재하고 21 게이지 바늘을 사용하여 200 마이크로리터의 화물을 주입하고 시료당 최소 3개의 블랙 96웰 플레이트에 하이드로겔을 장착한다.
그런 다음 광학적으로 명확한 접착판 씰로 플레이트를 밀봉하여 증발을 방지하고 온도 제어, 흔들림 및 운동 읽기 프로그래밍이 장착된 플레이트 판독기에 플레이트를 삽입합니다. 하이드로겔 캡슐화된 세포 생존가능성을 평가하기 위해 21게이지 바늘을 사용하여 150마이크로리터의 하이드로겔을 샘플당 3개의 우물에 적절한 농도를 포함하는 하이드로겔을 투명 하 고 96웰 플레이트에 넣고 하이드로겔의 각 부피에 적합한 세포 배지 의 100 마이크로리터를 추가한다. 문화의 첫날, 각 샘플 그룹에 대한 적절한 시점에서 각 하이드로겔의 상체를 2 밀리머 칼세인 AM 용액의 50 마이크로리터로 교체하십시오.
30 분 잠복 후, 공초점 현미경 검사법에 의해 각 우물의 중심을 이미지. 캡슐화된 세포의 능력을 평가하여 주사 전에 주사기에 정착하기 위해, PBS 농도에서 밀리리터당 6개의 세포로 10번으로 관심 있는 세포를 희석시키고 실온에서 10분 동안 50마이크로리터의 마이크로리터로 세포를 얼룩지게 한다. 인큐베이션의 끝에서, 하이드로겔의 500 ~ 700 마이크로리터와 세포를 혼합하고 21 게이지 바늘을 사용하여 샘플 당 적어도 하나의 큐벳의 바닥에 하이드로겔을 함유하는 세포의 100~200 마이크로리터를 주입한다.
그런 다음 주입 직후와 시드 후 1~ 4시간 후에 공초점 현미경의 단계에 평평하게 누워 있는 큐벳을 이미지하여 세포가 하이드로겔에 정착했는지 또는 중단된 상태를 관찰합니다. 겔의 전단 숱이 나고 자가 치유 능력은 각각 유동 스윕 및 스텝 전단 프로토콜을 사용하여 관찰될 수 있다. 초당 0.1에서 100라디안 범위의 선형 점탄성 정권에서 진동 전단 주파수 스윕 실험을 이용한 저장 및 손실 계수의 특성화가 고체와 같은 특성을 나타낸다.
전형적으로 경직제에 대한 낮은 주파수에서 관찰된 전단 저장 및 손실 계둘리의 크로스오버가 없어야 하며, 크로스오버 이벤트는 약한 하이드로겔 제형에 대해 예상될 수 있다. PNP 하이드로겔의 폴리머 함량을 다양화하면 폴리머 네트워크를 통한 화물의 확산과 재료로부터의 방출 속도에 직접적인 영향을 미칠 수 있다. PNP 하이드로겔은 열 불안정에 취약한 화물을 안정화하여 화물 유통 기한을 상당히 연장하고 콜드 체인 저장 및 유통에 대한 의존도를 줄일 수 있습니다.
인테그린 모티프의 포함은 세포 요법을 위한 PNP 하이드로겔을 적응시키는 데 유용할 수 있습니다. 캡슐화된 세포는 시각화 및 정량화를 용이하게 하기 위해 형광으로 표지될 수 있다. 예를 들어, 접착 부위가 부족한 제형은 캡슐화된 세포에 비해 증식하는 데 실패하고 RGD와 같은 접착 모티프를 갖는 제형에 비해 증식하는 데 실패하기 때문에 낮은 세포 생존력을 가질 것이다.
우리는 여전히 제형의 변화가 폴리머 매트릭스의 유변학적 특성과 동적 메쉬에 어떤 영향을 미치는지 탐구하고 있습니다. 우리는 또한 HYDROgel 내의 분자의 확산을 연구하기 위하여 FRAP를 이용합니다. 이 물질은 지속적인 납품이 약 납품, 백신 발달 또는 암 면역 요법에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지에 관하여 새로운 생물학 질문을 하기 위하여 이용될 수 있습니다.
