Nosso protocolo facilita a formulação de hidrogéis de polímeros-nanopartículas para uso como biomateriais. Esperamos que os pesquisadores desenvolvam esse material para aplicações translacionais e explorem questões biológicas básicas. Hidrogéis PNP são facilmente injetados através de agulhas e cateteres de pequeno diâmetro, mas rapidamente se auto-curam após a injeção.
Isso permite a entrega não invasiva controlada de drogas e células em longas escalas de tempo. Essa tecnologia ultrapassa os limites para a terapia localizada e a liberação prolongada de medicamentos, com implicações para condições amplas do câncer à regeneração tecidual à imunização passiva. Para sintetizar nanopartículas por nano precipitação, adicione 50 miligramas de polímero PEG-PLA a um frasco de cintilação de vidro de oito mililitros e adicione um mililitro de acetonitrilo ao frasco.
Vórtice para dissolver completamente. Em seguida, adicione 10 mililitros de água ultra pura a um frasco de cintilação de vidro de 20 mililitros com uma pequena barra de agitação e coloque o frasco em uma placa de agitação definida para 600 revoluções por minuto. Use uma pipeta de 200 microliter para adicionar um mililitro da solução de solvente de polímero dropwise ao frasco de água.
As nanopartículas de concha-núcleo se formarão à medida que a solução de solvente de polímero é rapidamente dispersada por toda a água. Verifique o tamanho das partículas por dispersão dinâmica de luz de acordo com os protocolos padrão. Em seguida, transfira a solução de nanopartículas para uma unidade de filtro centrífugo para concentrar a solução para menos de 250 microliters e resuspenque as nanopartículas em um buffer apropriado.
Para preparar o hidrogel, adicione 333 miligramas de solução de estoque HPMC-C12 de 6%HPMC-C12 a uma seringa de bloqueio Luer de um mililitro e adicione 500 microliters da solução de estoque de nanopartículas de 20% e 167 microliters de PBS a um frasco de oito mililitros. Após a mistura, use uma agulha para encher outra seringa de bloqueio Luer mililitro com a solução diluída de nanopartículas e conecte as duas seringas a uma batedeira de cotovelo. Misture as duas soluções por aproximadamente 60 ciclos até que um material hidrogel branco homogêneo e opaco se forme.
Para medir as propriedades reológicas do hidrogel formulado, injete o volume apropriado de hidrogel de acordo com a lacuna de geometria selecionada no centro de uma placa de reômetro serrilhada e utilize testes oscilatórios e de fluxo para medir as propriedades mecânicas da amostra. Para caracterizar a liberação de drogas do hidrogel, primeiro, prepare um capilar de vidro usando epóxi para selar uma extremidade de cada tubo. Quando o epóxi estiver definido, use uma agulha hipodérmica de 4 polegadas de 22 bitola para injetar de 100 a 200 microliters de hidrogel em um mínimo de três tubos por amostra, e adicione cuidadosamente 200 a 300 microliters de PBS em cada volume de hidrogel.
Nos pontos de tempo apropriados, de acordo com a escala de tempo prevista de liberação de drogas, use uma agulha para remover cuidadosamente o PBS de cada capilar sem perturbar a superfície do hidrogel e adicionar um novo volume de PBS. Na conclusão do estudo, analise as alíquotas coletadas da PBS com um método adequado para quantificar a quantidade de droga liberada em cada ponto de tempo. Para caracterizar a estabilidade térmica da insulina encapsulada em gel, carregue tanto a insulina quanto a tia de táfala T no hidrogel como demonstrado e use uma agulha de calibre 21 para injetar 200 microliters da carga e sonda carregada de hidrogel em pelo menos três poços de uma placa preta de 96 poços por amostra.
Em seguida, sele a placa com uma vedação de placa adesiva opticamente clara para evitar a evaporação e insira a placa em um leitor de placa equipado com controle de temperatura, agitação e uma programação de leitura cinética. Para avaliar a viabilidade celular encapsulada por hidrogel, use uma agulha de calibre 21 para injetar 150 microliters de hidrogel contendo a concentração adequada de células em cada um dos três poços por amostra em uma placa de fundo claro de 96 poços e adicione 100 microliters do meio celular apropriado em cada volume de hidrogel. No primeiro dia de cultura, substitua o supernascer em cada hidrogel no ponto de tempo apropriado para cada grupo amostral por 50 microliters de duas soluçãos de Calcein AM mililitro.
Após uma incubação de 30 minutos, imagem o centro de cada poço por microscopia confocal. Para avaliar a capacidade das células encapsuladas de se instalarem em uma seringa antes da injeção, diluir as células de interesse para uma única vez 10 para as seis células por mililitro na concentração de PBS e manchar as células com 50 microlitradores de dois mililitros Calcein AM por 10 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, misture as células com 500 a 700 microliters de hidrogel como demonstrado e use uma agulha de calibre 21 para injetar de 100 a 200 microliters de células contendo hidrogel no fundo de pelo menos um cuvette por amostra.
Em seguida, imagem as cuvetas deitadas planas em seus lados no palco de um microscópio confocal imediatamente após a injeção e em uma e quatro horas após a semeadura para observar se as células se estabeleceram no hidrogel ou se permaneceram suspensas. As capacidades de afinamento e auto-cura do gel podem ser observadas usando protocolos de varredura de fluxo e cisalhamento, respectivamente. A caracterização do moduli de armazenamento e perda usando um experimento de varredura de frequência de cisalhamento oscilatório no regime viscoelástico linear na frequência varia de 0,1 a 100 radianos por segundo revela as propriedades sólidas.
Normalmente não deve haver um crossover do armazenamento de tesoura e moduli de perda observado em baixas frequências para formulações mais rígidas, enquanto eventos crossover podem ser esperados para formulações de hidrogel mais fracas. A variação do teor de polímeros dos hidrogéis PNP pode ter um impacto direto na difusão da carga através da rede de polímeros e na taxa de liberação dos materiais. Os hidrogéis PNP também podem estabilizar a carga suscetível à instabilidade térmica, ampliando consideravelmente a vida útil da carga e reduzindo a dependência do armazenamento e distribuição da cadeia fria.
A inclusão de motivos integrin pode ser útil para a adaptação de hidrogéis PNP para terapias celulares. As células encapsuladas podem ser rotuladas fluorescentemente para facilitar sua visualização e quantificação. Por exemplo, formulações sem locais de adesão terão uma baixa viabilidade celular, pois as células encapsuladas não se proliferam em comparação com células encapsuladas e formulações com motivos de adesão, como RGD.
Ainda estamos explorando como as mudanças na formulação afetam as características reológicas e a malha dinâmica da matriz do polímero. Também usamos FRAP para estudar a difusão de moléculas dentro do hidrogel. Esses materiais podem ser usados para fazer novas perguntas biológicas sobre como o parto sustentado pode afetar o fornecimento de medicamentos, o desenvolvimento de vacinas ou a imunoterapia contra o câncer.
