우리는 핵 자기 공명 연구를 수행합니다. 이를 통해 용액에서 단백질, RNA 및 DNA의 구조를 결정할 수 있습니다. 이러한 생체 분자는 구성 요소이며 세포의 구성 요소이며 여기에 제시하는 프로토콜은 소분자의 스크리닝 및 이러한 표적에 대한 결합과 관련이 있습니다.
이러한 분자에서 우리의 의약 화학 및 구조 생물학은 질병과 싸우는 신약을 도출 할 수 있습니다. 우리 기술의 주요 장점은 단백질과 같은 분자 표적의 품질을 완전히 제어할 수 있고 소분자 단편 및 약물의 품질을 완전히 제어할 수 있으며 광범위한 친화도의 결합을 위해 단백질을 스크리닝할 수 있다는 것인데, 이는 다른 방법론에 비해 장점입니다. NMR 측정을 위한 스크린 샘플을 준비하려면 샘플 준비 로봇을 사용하여 768개의 화합물을 8개의 96웰 플레이트에 분배하여 혼합물당 4.2밀리몰의 최종 농도로 12개의 단편을 포함하는 64개의 혼합물을 얻습니다.
적절한 스크리닝 완충액에 희석된 관심 생체 분자 표적을 적절한 수의 바코드가 부착된 3mm NMR 고처리량 시료 교환 튜브로 옮기고 로봇을 사용하여 각 리간드 혼합물 10마이크로리터를 표적 생체 분자의 각 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 로봇이 용액을 철저히 혼합하도록 합니다. NMR 획득을 위해 샘플을 분광계에 로드합니다.
분광계 소프트웨어를 연 다음, 리간드 기반 실험을 위한 파라미터 세트와 펄스 시퀀스를 선택합니다. 나열된 모든 실험에 대해 여기 조각(excitation sculpting)을 물 억제(water suppression)로 선택합니다. 불소-19 스크리닝의 경우 1D 및 T2 실험을 모두 선택합니다.
스펙트럼 폭을 220ppm으로, 여기 주파수를 140ppm으로, 분석 시간을 1시간에서 5시간 사이로 선택합니다. T2의 경우 CPMG 시간은 5밀리초에서 100밀리초 사이로 번갈아 가며 사용됩니다. T1r 및 T2 실험을 기록합니다.
포화 전달 차이를 의사 2D로 기록합니다. 두 개의 단일 1D 스펙트럼을 처리하려면 릴렉스 옵션의 유무에 관계없이 AU 프로그램 ProcStd 함수를 사용하십시오. WaterLOGSY는 용매 신호에 대해 음수로 단계적으로 단계적으로 처리되어야 하는 단일 1D입니다.
수소 스크리닝 데이터를 분석하려면 단편 기반 스크리닝 도구에 대한 지침에 따라 스크리닝 캠페인의 생체 분자 자기 공명 NMR 데이터를 저장하여 각 스크리닝 혼합물에 샘플에서 측정된 다양한 실험이 포함된 하위 디렉토리가 있는 디렉토리를 갖습니다. 생체 분자 표적 없이 샘플에서 저장된 모든 데이터를 가지고 참조 스펙트럼을 저장하지만 혼합물과 단일 화합물은 서로 다른 디렉토리에 저장합니다. 수집 된 데이터가 포함 된 디렉토리에 대한 직접 경로를 만들고 모든 혼합물에 고유 한 디렉토리가 있어야하는 NMR 디렉토리를 선택하십시오.
CSV, 조각 화면, XML 문서 및 BAC 파일도 데이터의 NMR 디렉터리에 복사되었는지 확인합니다. 스크리닝된 샘플에 대해 조각 기반 스크리닝 도구를 사용하려면 조각 기반 스크리닝 프로젝트 기호를 분석 창 가운데로 끕니다. 이전에 저장된 데이터 세트가 복사된 경우 기호가 나타나야 합니다.
조각 기반 스크리닝 옵션 창이 자동으로 열립니다. 믹스 이름, 각 프래그먼트 이름 및 각 프래그먼트를 믹스로 나누는 내용이 포함된 CSV 칵테일 파일을 선택합니다. 단일 단편의 모든 측정된 스펙트럼이 포함된 참조 리간드 스펙트럼 폴더를 정의하고, 일반적으로 조사된 표적이 없는 혼합물의 데이터 세트를 포함하는 참조 빈 실험 폴더를 정의합니다.
조사된 스펙트럼 및 스펙트럼 표시 색상을 정의하려면 스펙트럼 유형 탭을 열고 프로세스 데이터에 따라 사양 유형을 설정합니다. Display Layout 탭에서 사양 유형에 따라 비교할 스펙트럼을 정의합니다. 그런 다음 확인을 클릭하여 프로젝트를 시작합니다.
데이터가 처리되는 동안 모든 칵테일 믹스와 각 믹스의 리간드를 요약하는 테이블이 있는 별도의 창이 열립니다. 셀을 두 번 클릭하여 해당 데이터셋을 엽니다. 바인더를 할당하기 전에 기준 피크가 서로 일치하고 화학적 이동이 동일한지 확인하십시오.
차이점이 발견되면 프로세스 탭을 열고 직렬 처리 옵션을 사용하여 수정하십시오. 불소-19 혼합물에 대한 첫 번째 분석의 경우 분석 탭을 열고 적분 함수를 선택합니다. 혼합물의 각 단편에 대해 해당 불소-19 신호에 대한 명확한 통합 영역이 정의되어 있는지 확인합니다.
내보내기 통합 영역을 저장하여 나중에 사용할 수 있도록 통합 파일을 내보내고 사용된 통합 파일을 적절한 설치 디렉토리에 저장합니다. 불소-19 데이터의 경우, 조사된 표적이 있거나 없는 데이터 세트를 열고, 분석 탭에서 통합 영역 통합 및 읽기를 클릭하여 해당 통합 파일을 현재 스펙트럼에 로드합니다. 그런 다음 저장 후 돌아가기를 클릭하여 적분 탭에서 통합 영역 목록을 찾고 다운스트림 분석을 위해 이 정보를 스프레드시트에 복사합니다.
단편 라이브러리에 있는 리간드의 분자 구조 또는 구성은 입증된 대로 분자 신뢰 소프트웨어를 사용하여 분석되고 결과는 그래픽 출력으로 표시됩니다. 주황색은 조각이 구조나 농도에 불일치를 보임을 나타냅니다. 녹색 우물은 조각이 일관성이 있음을 나타냅니다.
이 대표적인 분석에서, 사내 라이브러리에서 하나 또는 여러 개의 불소 그룹을 함유하는 103 개의 단편을 혼합물 당 20 내지 21 개의 단편으로 구성된 5 개의 혼합물로 나누었다. 불소-19 횡방향 이완 실험은 CPMG 펄스 트레인을 적용한 각 혼합물에 대해 측정되었습니다. 역치는 이러한 전형적인 티아민 단백질 티로신 키나아제 A 및 RNA 스펙트럼에서 관찰되는 바와 같이 혼합물에서 결합제, 약한 결합제 또는 비결합제를 정의하는 데 유용합니다.
이 대표적인 분석에서 히트 1은 T2 약 50 %의 감소와 6 헤르츠 이상의 화학적 이동을 보였다. WaterLOGSY는 양성으로 간주되는 신호에 큰 변화를 나타내지 않았습니다. 그러나 3 건의 실험 중 2 건이 양성 이었기 때문에이 단편은 히트로 간주되었습니다.
두 번째 히트의 경우 T2는 신호 강도가 약 80% 감소한 것으로 나타났습니다. WaterLOGSY에 대해서도 명확한 신호 변화가 관찰되었습니다. 이 실험에서는 화학적 이동이 충분하지 않았지만 이전의 두 가지 기준이 긍정적이었기 때문에 여전히 히트로 간주되었습니다.
이러한 방법의 최종 목표는 예를 들어 효소와 같은 신약 또는 고친화성 억제제를 개발하는 것이며, 이 경우 의약 화학이 이러한 새로운 분자를 인수하고 합성하지만 구조 생물학, 여기에 적용하는 기술은 의약 화학을 안내하고 그 접근 방식을 훨씬 더 빠르게 만들 수 있습니다.
