이 프로토콜은 존재를 감지하고 많은 생물학적 과정에 점점 더 인식되는 중요성의 분자인 글리코사미노글리칸의 길이를 측정하는 데 사용할 수 있는 간단한 기술을 설명합니다. 이 기술은 대부분의 생명 과학 실험실에 쉽게 적응할 수 있습니다. 비교 가능한 글리코믹 기술은 종종 글리코케화학 연구 실험실에서만 볼 수 있는 장비와 전문 지식이 필요합니다.
이 기술은 글리코칼릭스, 인체의 내피 및 상피 표면을 줄 다당류 코트를 연구에 관심이있는 연구자에게 특히 유용 할 수 있습니다. 먼저 빈 카세트를 PAGE 탱크에 넣습니다. 15 밀리리터 튜브에 10% 암모늄 감산에서 갓 제조된 60 마이크로리터와 젤 용액 을 혼합하여 해결 젤을 캐스팅합니다.
그런 다음 TEMED의 마이크로리터 10기를 추가합니다. 튜브를 부드럽게 2~3번 반전시다. 파이펫을 사용하여 활성 폴리 아크릴아미드 젤 용액10 밀리리터를 카세트에 빠르게 추가합니다.
2밀리리터의 탈이온화된 여과된 물로 오버레이하고, 30분 동안 젤을 중합할 수 있게 한다. 해결 젤이 완전히 중합된 후 오버레이 된 물을 버리십시오. 스태킹 젤 용액 3밀리리터를 15밀리리터 튜브에 갓 준비한 10% 암모늄 감산의 90 마이크로리터와 혼합하여 스태킹 젤을 캐스팅합니다.
그런 다음 TEMED의 마이크로 리터 3 개를 추가하고 튜브를 부드럽게 2 ~ 3 번 반전시면 됩니다. 파이펫을 사용하여 카세트가 가장자리에 채워지도록 응고된 해결 젤 위에 스태킹 젤 용액을 빠르게 추가합니다. 빈 폴리아크릴아미드 젤 카세트에 포함된 빗을 완전히 삽입하고 스태킹 젤이 30분 동안 중합되도록 합니다.
젤이 중합되면 카세트 바닥에서 테이프 스트립을 제거하고 카세트를 PAGE 탱크 어셈블리에 다시 넣습니다. 상하 챔버를 각각의 버퍼 솔루션으로 채웁니다. 말린 글리코아미노글리칸 샘플을 최소한의 필요한 양의 탈이온화 여과된 물로 용해하고 샘플 적재 버퍼와 일대일 비율로 혼합합니다.
샘플과 HS 올리고당 사다리를 젤에 적재합니다. 젤을 100볼트에서 5분간 예전한 다음, 해결 젤 용액의 아크릴아미드 비율에 따라 20~100분 동안 200볼트에서 실행합니다. 실행이 완료되면 카세트를 분해하고 신중하게 탈이온 여과 된 물로 채워진 큰 깨끗한 용기로 젤을 추출합니다.
그런 다음 물을 버리고 알시안 블루 염색 용액에 젤을 5 분 동안 염색하십시오. 알시안 블루 얼룩을 버리고, 알시안 블루 스테닝 용액의 대부분이 제거 될 때까지 탈이온 화 된 여과된 물로 2 ~ 3 번 신속하게 씻으십시오. 젤을 실버 질산염 염색 용액에 넣고 신선한 깨끗한 용기에 30분간 염색합니다.
그런 다음 탈온화 된 물에 각각 2 ~ 3 번 세척하여 실버 염색 용액을 완전히 제거하십시오. 물을 버리고 개발 솔루션을 추가합니다. 밴드의 모양을 위해 조심스럽게 젤을 관찰하십시오.
얼룩의 품질과 로드된 샘플의 질량에 따라 개발은 몇 초에서 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 원하는 밴드가 보이자마자 개발 용액을 즉시 폐기하고 STOP 용액으로 젤을 간단히 세척합니다. 폴리아크릴아미드 젤 전기포광에 의한 밀도 의존적 해결 후 알시안 블루및 은 염색 기술을 사용하여 분리되고 정제된 글리코아미노글리칸을 시각화하였다.
이 그림에서 볼 수 있듯이, 상이한 폴리머 길이의 헤파란 황산염 올리고당류는 이 PAGE 기반 접근법을 사용하여 쉽게 검출할 수 있었다. 이 방법의 검출 한계는 0.5 마이크로그램으로 낮게, 기술이 생물학적 견본에서 분리되고 정제된 글리코사미노글리칸을 검출하는 데 매우 민감하다는 것을 보여줍니다. 이 방법을 사용하여 시각화된 4개의 다른 헤파린 황산염 올리고당 오리고당라이드 중, 불가분하지 않은 헤파린은 가장 쉽게 검출할 수 있었다.
이 샘플에서 각 개별 밴드의 밀도는 정제 된 헤파린 올리고당라이드의 동등한 질량에 의해 생성 된 밴드보다 낮습니다. 액체 생물학적 샘플에서 글리코아미노글리칸 정제의 효율은 원래 글리코미노미노글리칸의 상대적으로 낮은 농도를 포함하는 마우스에서 수집된 기관지포라 라베지 샘플을 사용하여 평가되었다. 또한, 이 기술의 성공은 전체 폐 균질에서 분리된 헤파린 황산염을 사용하여 입증되었으며, 이는 약 10개의 소멸 서브유닛과 동일한 가장 작은 파편으로 충분한 양의 분리된 헤파린 황산염을 산출했습니다.
새로 준비된 시약을 사용하고 이 프로토콜에 사용되는 모든 시약을 필터링하는 것이 매우 중요합니다. 이 기술을 성공적으로 수행하기 위해 최고 순도와 품질의 시약을 사용하는 것이 중요합니다.
