우리는 세포 배양 supernatants에서 MMPs의 농도를 증가 단백질 concentrators의 사용을 제안에 대한 박사 S. 레슬러를 (분자 및 세포 생물학의학과 의학의 베일러 대학) 감사드립니다. 이 프로젝트는 부인이 클리포드 엘더 화이트 그레이엄 둘러 싸인 연구 기금과 CB에 대한 NIH / NIAMS (AR059838)에서 보조금에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

1. 로딩과 젤 실행 <ol><li> 모든 샘플은 효소의 기능을 유지하기 위해 충분히 준비하고 수집 후 즉시 사용하거나 -80에서 냉동 보관해야 ° C. 샘플 감소 대리인이 없어야합니다 (예 : β - 메르 캅 토 에탄올) 또는 겔로드하기 전에 삶은 수 있습니다. </li><li> 카세트 안에 젤이 들어있는 주머니를 열고, 탈이온수와 카세트를 씻어. <ul><li> 카세트의 바닥과 젤 상단에서 빗에서 보호 테이프를 제거합니다. </li><li> 실행 버퍼 (탈이온수에 1X로 희석)와 우물을 세 번 씻어. </li><li> 미니 셀, 카세트의 작은 면이 안쪽에 직면 있도록에 젤를 놓습니다. 젤 장력 웨지와 장소에 잠금. 미니 셀은 병렬로 하나 또는 두 개의 젤을 실행할 수 있습니다. </li><li> 웰스 해발 1X 실행 버퍼 맨 (내부) 챔버를 기입 어떤 누출이 있는지 확인합니다. 누출의 경우에는 버퍼를 제거하고 젤 조정. </li><li> 1X 실행 버퍼와 하부 챔버 입력합니다. </li></ul></li><li> 물론 하나의 단백질 분자 마커 10 μL를로드합니다. <ul><li> 겔 - 로딩 팁 (각 샘플 사이의 변경)를 사용하여 젤의 우물로 겔 로딩 버퍼 및 샘플과 부하의 동일한 금액을 섞는다. 이러한 웰스는 20 μL 총와 로드할 수 있습니다. </li></ul></li><li> 미니 셀에 뚜껑을 놓고 전원 공급 장치에 전극 코드를 연결합니다. 에있는 전원 공급 장치 스위치 90 분 동안 지속적인 125 V에서 실행으로 설정합니다. 현재 순환을 나타내는 하단 챔버의 철사에 작은 거품의 형성을 확인합니다. </li><li> 첫 번째 젤을 실행하는 경우, 지표로 읽어 버퍼에 포함된 bromophenol 파란색을 사용하여 마이 그 레이션 매 15 분 진행 상황을 모니터링합니다. 표시기 염료가 젤 하단에 도달할 때까지 겔 실행하자. </li></ol> 2. 젤 Renaturing 및 개발 <ol><li> 각 젤 들어, 탈이온수 모두에 1X renaturing 버퍼와 버퍼를 denaturing 200 ML 100 ML을 준비합니다. </li><li> bromophenol 푸른 추적 염료는 젤 하단에 도달하면, 전원 공급 장치를 끄고 미니 셀을 열고, 그리고 젤을 제거하십시오. 겔 나이프 (또는 무게 주걱)를 사용하여 카세트의 두 측면을 분리합니다. 젤의 방향을 표시하기 위해 모서리를 잘라. </li><li> 조심스럽게 100 ML renaturing 버퍼와 함께 용기에 카세트와 장소에서 젤을 제거하십시오. 부드러운 교반과 실온에서 30 분 알을 품다. </li><li> renaturing 버퍼를 제거하고 젤로 버퍼를 개발 100 ML를 추가합니다. 부드러운 교반과 실온에서 30 분 알을 품다. </li><li> 개발 버퍼를 제거하고 겔을 개발하여 버퍼의 100 ML 더 추가합니다. 37 (16~18시간) 밤새 품어 ° C. </li><li> 개발 버퍼를 제거하고 실온에서 부드럽게 교반 하에서 탈이온수로 세 번 (5 분 각각) 헹굼. </li><li> 그들은 겔 얼룩 후 작거나 보이지 않는가 될로서 단백질 표준 밴드의 정확한 위치를 저장하는 젤 스캔. </li><li> 겔에 SimplyBlue Safestain 20 ML을 추가하여 겔 스테인. 부드러운 교반하에 실온에서 1 시간 품어. </li><li> SimplyBlue SafeStain 부드러운 선동에 따라 실내 온도에 한 시간 동안 100 ML 이상의 탈이온수에 드 얼룩 젤을 제거합니다. </li><li> 보다 나은 결과를 위해 부드러운 교반에 따라 상온에서 한 시간 이상 신선한 탈이온수과 부화로 바꿉니다. </li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> 조심스럽게 플라스틱 시트 보호대에 물과 장소에서 젤을 제거하십시오. </li><li> 300 DPI 이상의 해상도로 젤을 검사합니다. TIFF 형식 (그림 1A)에서 이미지를 저장합니다. </li><li> ImageJ (또는 다른 유사한 소프트웨어)와 함께 밴드 농도를 측정. <ul><li> ImageJ (그림 1A)에서 TIFF 파일을 엽니다. </li><li> 선택하여 흑백의 시각화 &#39;이미지를&gt; 입력&gt; 8 비트 &quot;(그림 1B). </li><li> 적어도 두 번 이상은 (이 소프트웨어 요구 사항입니다)보다 넓은 사각형을 그리기, 처음 밴드를 대략적으로 사각형 선택 도구를 사용하십시오. </li><li> &quot;1&quot;을 누르거나 &quot;분석&gt; 젤&gt; 선택 피르스트 레인 &#39;과 밴드가 설명됩니다를 선택합니다. </li><li> 새로운 사각형이 나타납니다 다음 밴드로 이동하고 &quot;분석&gt; 젤&gt; 선택 옆에있는 차선 &#39;을 선택합니다. 모든 밴드는 (그림 1B)을 선택 때까지 반복합니다. </li><li> &quot;3&quot;을 누르거나 각 밴드 (그림 1C)에 대한 프로필 계획을 생성하기 위해 &quot;분석&gt; 젤&gt; 플롯 차선&quot;를 선택하십시오. </li><li> 관심의 정상은 완전히 밀폐된 공간되도록 기본 라인을 그릴 수있는 직선을 선택 (이미 자동으로 선택한다)를 사용합니다. </li><li> 지팡이 도구를 선택하고 그것을 선택 각각의 최대 내부를 클릭하십시오. </li><li> 선택한 각 피크에 대한 영역 테이블을 얻기 위해 &quot;분석&gt; 젤&gt; 라벨 봉우리&quot;를 선택하십시오. 이러한 데이터는 (F 같은 꾸몄다 수 있습니다igure의 1D) 또는이 선택한 밴드의 가치에 정상화 수 있습니다. 결과 통계적 중요성을 결정하기 위해 여러 복제 젤에서 값을 풀링 때 정상화가 특히 중요합니다. </li></ul></li></ol> 4. 대표 결과 우리는 MMP - 2 (그림 1A)의 다른 금액을 포함하는 다양한 세포 배양 supernatants와 함께 로드된 11 우물로 젤을 보여줍니다. 이 젤의 직접 관찰이 우물의 일부 사이 MMP - 2 농도에서 확실한 차이를 보여줍니다. 예를 들어, 우물 # 4와 5는 훨씬 더 MMP - 2 잘 # 11 또는 # 10 잘보다가 포함되어있다는 사실을 분명하다. 밴드의 객관적인 부량을 위해 우리는 잘 # 11 우물 # 4, 5 및 약 2 배 차이 MMP - 2 금액의 약 4 배 차이를 확인, ImageJ 소프트웨어 (그림 1B - D)와 densitometry를 사용했습니다 잘 # 10 우물 # 4와 5 사이에서 MMP - 2 정도입니다. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 젤라틴 zymography에 의해 MMP - 2의 감지. 젤라틴의 젤, 스캔한 이미지. 그럼 숫자가 젤 상단에 표시됩니다. B 같은 젤처럼 검정과 densitometry를 위해 흰색 표시됩니다. 각 밴드는 ImageJ에 사각형과 함께 선정되었다. C,에 표시된 겔에 대한 densitometry 프로파일의 두 가지 예로 A와 B (밴드 # 4와 # 11). 직선은 닫힌 영역을 만들려면 각 피크의 기지에 그립습니다. D, 밴드 # 1의 밀도에 A와 B 전 (왼쪽) 후 (오른쪽) 정상화에 표시된 젤에 대한 피크 영역의 플롯. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2.이 그림은 zymography가 세미 양적 기술로 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 우리는 7 연속 우물의 시리얼 dilutions을 (1:1 dilutions의 단계)로드 및 프로 MMP - 2와 MMP - 2 모두에 대한 밴드의 밀도를 측정했습니다.

<ol>
	<li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+matrix+metalloproteinases+in+the+morphogenesis+of+the+cerebellar+cortex.">The role of matrix metalloproteinases in the morphogenesis of the cerebellar cortex.</a> Cerebellum. 4, 239-245 (2005).</li><li>Pasternak, B., Aspenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteinases+and+their+inhibitors+-+diagnostic+and+therapeutic+opportunities+in+orthopedics.">Metalloproteinases and their inhibitors - diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics.</a> Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).</li><li>Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases:+regulators+of+the+tumor+microenvironment.">Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment.</a> Cell. 141, 52-67 (2010).</li><li>Lagente, V., Boichot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+matrix+metallopreoteinases+in+the+inflammatory+process+of+respiratory+diseases.">Role of matrix metallopreoteinases in the inflammatory process of respiratory diseases.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 48, 440-444 (2010).</li><li>Rodr&#237;guez, D., Morrison, C. J., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metallopreoteinases:+what+do+they+not+do?+New+substrates+and+biological+roles+identified+by+murine+models+and+proteomics.">Matrix metallopreoteinases: what do they not do? New substrates and biological roles identified by murine models and proteomics.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1803, 39-54 (2010).</li><li>Bourboulia, D., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+(MMPs)+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+(TIMPs):+positive+and+negative+regulators+in+tumor+cell+adhesion.">Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): positive and negative regulators in tumor cell adhesion.</a> Semin. Cancer Biol. , (2010).</li><li>Heussen, C., Dowdle, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+analysis+of+plasminogen+activators+in+polyacrylamide+gels+containing+sodium+dodecyl+sulfate+and+copolymerized+substrates.">Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates.</a> Analytical Biochem. , 102-196 (1980).</li><li>Lombard, C., Saulnier, J., Wallach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+of+matrix+metalloproteinases+(MMPs)+activities:+a+review.">Assays of matrix metalloproteinases (MMPs) activities: a review.</a> Biochimie. 87, 265-272 (2005).</li><li>Snoek-van Beurden, P. A., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymographic+techniques+for+the+analysis+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors.">Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> Biotechniques. 38, 73-83 (2005).</li><li>Kupai, K., Szucs, G., Cseh, S., Hajdu, I., Csonka, C., Csont, T., Ferdinandy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+activity+assays:+importance+of+zymography.">Matrix metalloproteinase activity assays: importance of zymography.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 205-209 (2010).</li><li>Kleiner, D. E., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+zymography:+detection+of+pictogram+quantities+of+gelatinases.">Quantitative zymography: detection of pictogram quantities of gelatinases.</a> Anal. Biochem. 218, 325-329 (1994).</li><li>Yu, W. H., Woessner, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-enhanced+zymographic+detection+of+matrilysin+and+collagenases.">Heparin-enhanced zymographic detection of matrilysin and collagenases.</a> Anal. Biochem. 293, 38-42 (2001).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 세포 배양 supernatants에서 MMP - 2의 zymographic 분석을 수행하는 방법을 증명하고있다. 젤에 로드할 샘플의 양은 경험적으로 관심의 기원과 MMP에 따라 결정되어야합니다. 단백 분해 효소가 밴드의 영역에서 소화 수있는 너무 많은 기판이 그대로 너무 로딩하는 동안 거의 감지하지 않도록 할 수도로드하면 채도가 발생할 수 있습니다. 필요한 경우, 샘플은 이전에 읽어 버퍼 또는 개발 시간과 믹싱에 탈이온수에 희석 수있는 데 4 시간이 하루에서 단축하실 수 있습니다. 그것은 concentrators (예 : Millipore 카탈로그 # UFC803024)를 사용하여 솔루션에 단백질을 집중하는 것도 가능합니다. 밴드가 겨우 보이는 남아있다면, 그것도 최대 48 시간, 시간의 긴 기간 동안 젤을 개발해야 할 수도 있습니다. 조직 문화 supernatants에서 샘플을 비교할 때, 그것은 태아 소 혈청 (및 기타 세라)가 결과에 영향을 미칠 수 MMPs를 포함 것을인지해야합니다. 이러한 이유로, 우리는 혈청이없는 배지에서 문화 이후 우리 supernatants 모두 수집합니다. 프로토콜의 단락 2.9 및 2.10에 명시된 세척은 소화 밴드의 얼룩 배경을 제거하기 위해 필요합니다. 더 이상 세척 시간은 젤 내내 기판의 얼룩 더 많은 배경을 제거 하겠지만도 희미합니다. 이상 세척 시간이 필요하는 경우, 우리는 최고의 명암으로 스캔을 선택 젤 매일 몇 시간을 스캔하는 것이 좋습니다. 이 기술은 다른 MMPs를 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 젤라틴들이 선호하는 기판이 아니므로 예를 들어, MMP - 9는 낮은 정도 MMP - 1, MMP - 8과 MMP - 13 또한 젤라틴 젤에 대한 감지, 그리고 수 있습니다. 카제인은 MMP - 11에 대한 선호하는 기판이며, 또한 MMP - 1의 탐지, MMP - 3, MMP - 7, MMP - 12 및 MMP - 13을 허용하면서 MMP - 1과 MMP - 13은 최고의 콜라겐 zymography에 감지 9. MMP - 7 (matrilysin)와 collagenases (MMP - 1과 MMP - 13) 때 카제인이나 젤라틴 젤 낮은 수준에서 현재 감지하기가 어렵습니다. 겔 로딩 시간에 샘플로 헤파린의 또한 MMP - 7에 대한 검색 제한을 대폭 향상시킵니다. MMP - 1과 MMP - 13의 경우, 헤파린은 전기 실행이 방법은 12 세 미만 이미 후 겔에 추가되어야합니다. zymography이 효소의 변성 및 renaturation 후 효소 활동을 측정 때문에, 그것은 샘플에있는 모든 MMPs의 활동을 측정합니다. 이것은 효소, 프로 효소, 그리고 내생 억제제 (예 : 팀프 - 2)에 바운드 효소를 포함합니다. 그것은 활성 효소의 밴드 밀도를 비교하여하고 약간 높은 분자량을 가지고되는, 프로 효소의의 예제에서 MMP 활성화 수준을 결정하는 그러나이 가능합니다. Zymography은 종종 MMP을 확인하기에 충분하지 않습니다. 알려진 분자량 표준 MMP의 마이 그 레이션 수준의 비교는 식별에 도움이 되나요하지만 이러한 표준의 일부가 감소 요원을 포함하고 비 절감 조건에서 사용할 때 그들이 9 가지 분자 무게를 나타낼 수 있다고 언급한다. 옵션은 테스트 샘플과 같은 겔에 가용성 재조합 MMP를 로드할 수 있습니다. MMPs는 그러나 겉보기 분자량의 변화를 유도, 다른 단백질에 연결되어있을 수 있습니다. 선택적 MMP 억제제는 interest.A 초 기술 (웨스턴 블롯, immunocytochemistry, 또는 엘리사)의 MMP가하는 것이 좋습니다 정체성에 약리 도구로 개발 버퍼에 부화 중에 젤 (또는 반 젤 컷의 일부)에 추가할 수 있습니다 관심 MMP의 식별에 도움이됩니다. 그것은 서양 Blots에 대한 검색 제한이 기​​술을 사용하면 잠재적으로 거짓 - 부정적인 결과로 이어지는, 자주 zymographic 젤보다 훨씬 낮은 것을 지적해야합니다.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EI0001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Power supply (model 302)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>93000-744</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EC61752BOX</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blue Juice gel loading buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10816015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel loading tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>53509-015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein molecular weight standard</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC5800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex Tris-Glycine-SDS running buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2675</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex zymogram renaturing buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2670</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex zymogram developing buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2671</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SimplyBlue SafeStain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC6060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Epson Perfection 4490 Photo Scanner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amazon</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageJ software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>http://rsbweb.nih.gov/ij/ </td>
<td>n/a</td>
<td>Authored by W. Rasband, NIH/NIMH</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

detection of functional matrix metalloproteinases by zymography

매트릭스 metalloproteinases (MMPs)는 아연 함유 endopeptidases 있습니다. 그들은 펩티드 채권 절단하여 단백질을 저하. 더보기보다 20 MMPs가 확인된과 구조와 기판 특이성 (collagenases, gelatinases, 멤브레인 타입 [MT - MMP] stromelysins, matrilysins, 등)에 따라 여섯 그룹으로 구분됩니다. MMPs는 세포 침공, 연골 저하, 조직 리모델링, 상처 치유, 그리고 embryogenesis에 중요한 역할을한다. 그들은 따라서 두 정상 프로세스 및 류마티스 관절염, 암, 또는 만성 폐쇄 폐 질환 1-6 많은 질병의 pathogenesis에 참여합니다. 여기서는 MMP - 2 (gelatinase A, 유형 IV collagenase), MMP 널리 표현에 초점을 맞출 것이다. 우리는 zymography 먼저 C. Heussen 및 EB 다우 70-10에 의해 1980 년에 설명 일반적으로 사용되는 매우 민감한 아직 단순하고, 기술에 의해 세포 배양 supernatants에서 MMP - 2를 검출하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 이 기술 세미 양적이며, 그것은 따라서 재조합 MMP 알려진 농도가 같은 겔 11 로드할 때 테스트 샘플에서 MMP 수준을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 그리고 젤라틴 (MMP - 2 기판), MMPs (예 : 세포 배양 supernatants, 소변, 또는 혈청)이있는 솔루션은 나트륨 dodecyl 황산염 (단백질 linearize하는 SDS)를 포함하는 polyacrylamide 젤에로드됩니다. 샘플 버퍼 (겔 로딩을 촉진하기) 샘플 점도를 높이기 위해 만들어진 것입니다, 추적 염료 (bromophenol 파란색, 샘플 마이 그 레이션을 모니터)를 제공 denaturing 분자를 (단백질 linearize)을 제공하고, 샘플의 산도를 제어합니다. 단백질은 다음 일정 마이 그 레이션 속도를 제공하기위한 실행 버퍼의 전류에 따라 마이 그 레이션하는 것이 허용됩니다. 이주의 거리는 반대로 단백질의 분자량 (작은 단백질이 큰 단백질은보다 젤을 통해 신속하게 이동하고 따라서 젤 아래 추가로 마이 그 레이션)와 상관 있습니다. 마이 그 레이션 후, 젤은 단백질이 효소 활동에 필요한 자신의 차 구조를, 다시 수 있도록 renaturing 버퍼에 배치됩니다. 젤은 다음 프로 테아제는 기판을 소화 수 있도록 설계된 개발 버퍼에 배치됩니다. 개발 버퍼는 또한 활성화된 MMPs에 비 proteolytic 프로 MMPs를 활성화하기 위해 P - aminophenylmercuric 아세테이트 (APMA)가 포함되어 있습니다. 다음 단계는 기판 (우리의 예제에서는 젤라틴) 염색법으로 구성되어 있습니다. 겔에서 여분의 염료를 세척 후, 테아제 소화 영역은 분명 밴드로 나타납니다. 명확하게 밴드가 더 집중 프로 테아제는가 포함되어 있습니다. 밴드 얼룩 강도는 다음 샘플 비교 있도록 같은 ImageJ 같은 소프트웨어를 사용, densitometry에 의해 결정하실 수 있습니다.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography at JoVE.com

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

이 프로토콜은 문화 supernatants이나 체액의 매트릭스 metalloproteinases 검출을위한 활동 기반의 분석을 설명합니다.

Zymography의 기능 매트릭스 Metalloproteinases의 감지

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

detection-of-functional-matrix-metalloproteinases-by-zymography

Research

JoVE Journal

Biology

83.5K 조회수.  Baylor College of Medicine. 이 프로토콜은 문화 supernatants이나 체액의 매트릭스 metalloproteinases 검출을위한 활동 기반의 분석을 설명합니다.

비디오: Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

광학 이미징과 비침습 감지를위한 형광 염료와 함께 줄기 세포를 라벨링

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

연구

생물학

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

엘리사에 의해 네이티브 손상 Nucleosomes에 포스트 translational 수정의 감지

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Macromolecular의 결정학에 의해 구조 결정에 대한 Lipidic Mesophases에서 재배 막 단백질의 수확 및 Cryo 냉각 크리스털

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

임의 Microseed 매트릭스 심사에 의해 단백질 결정화의 성공률을 향상

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

라이브의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; O157 : PMA-qPCR에 의한 H7 셀

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

대변​​ 글루코 코르티코이드 분석 : equids는 비 침습적 부신 모니터링

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

RNA 결합 단백질의 검출에 의해<em&gt; 체외</em지방 세포 문화&gt; RNA 풀다운

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.