1. 젤의 작성 <ol><li> Erlenmeyer 플라스크에 아가로 오스의 적절한 질량을 무게. 아가로 오스의 젤은 아 / V 비율 솔루션을 사용 준비가되어 있습니다. 겔의 아가로 오스의 농도는 -2 % 0.5 % 사이에 이르는 대부분의 젤과 함께 분리되는 DNA 조각의 크기에 따라 달라집니다. 버퍼의 볼륨 플라스크의 용량의 1 / 3보다 클 수 없습니다. </li><li> 아가로 오스 함유 플라스크에 버퍼를 실행하고 추가합니다. 혼합할 수있는 소용돌이. 버퍼를 실행하는 가장 일반적인 겔은 태 (40 MM 트리스 - 아세테이트, 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))와 TBE (45 MM 트리스-borate, 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))입니다. </li><li> 아가로 오스 / 버퍼 혼합 용융. 이것은 가장 일반적으로 전자 레인지에서 가열에 의해 이루어집니다, 또한 분젠 불꽃을 통해 할 수 있습니다. 30의 간격으로, 술병과 소용돌이 내용이 잘 섞어 제거합니다. 아가로 오스가 완전히 해소 때까지 반복합니다. </li><li> 0.5 μg / ML의 농도에 ethidium 브로마이드 (EtBr)를 추가합니다. 또는 젤도 전기 이후 물들일 수있다시간의 동일한 길이 버퍼를 실행에 destaining 다음 15-30 분를 위해 0.5 μg / ML의 EtBr이 포함된 버퍼를 실행에 phoresis. </li></ol> 참고 : EtBr이 의심되는 발암 물질이며 올바르게 기관 규제 당 폐기되어야합니다. EtBr이 포함된 젤을 다룰 때 장갑은 항상 착용한다. DNA의 염색법의 대체 염료를 사용할 수 있습니다 있으나 EtBr은 감성과 비용으로 인해 가장 인기가 남아있다. <ol start="5"><li> 아가로 오스는 65 ° C의 물을 욕조에 benchtop이나 배양에 의한 중 냉각하도록 허용합니다. 이렇게하지 ​​않으면 겔 트레이를 워프합니다. </li><li> 주조 장치로 겔 트레이를 놓습니다. 또한, 하나는 금형을 만드는 젤 트레이의 열린 가장자리를 찍어 수도 있습니다. 우물을 만들 겔 주형에 적절한 장식을 배치합니다. </li><li> 겔 금형에 용융 아가로 오스 하거라. 아가로 오스는 상온에서 설정하도록 허용합니다. 빗를 제거하고 겔 상자에서 젤 놓습니다. 또는 g엘 또한 플라스틱 포장에 싸여과 4에 저장할 수 ° C에서 사용 (그림 1)까지. </li></ol> 2. 젤 장치와 DNA 조각의 분리 설정 <ol><li> (그림 2) 분리되는 DNA 샘플에 염료를 로드할 추가합니다. 젤 로딩 염료는 일반적으로 6X 농도 (0.25 % bromphenol 파랑, 0.25 %의 크실렌의 cyanol, 30 % 글리세롤)에서 이루어집니다. 로딩 염료가 DNA 샘플이 날아 왔습니다 얼마나 멀리 추적할 수 있도록, 또한 예제 젤 밑으로 가라앉을 수 있습니다. </li><li> 원하는 전압으로 프로그램 전원 공급 장치 (전극 사이 1-5V/cm). </li><li> 겔 표면을 충당하기 위해 충분히 실행 버퍼에 추가합니다. 그것은 젤을 준비하는 데 사용되는 것과 동일한 실행 버퍼를 사용하는 것이 중요합니다. </li><li> 전원 공급 장치로 겔 상자의 리드를 연결합니다. 전원 공급 장치의 전원을 켜고 젤 상자와 전원 공급 장치가 모두 작동하는지 확인합니다. </li><li> 뚜껑을 제거합니다. 천천히그리고 신중하게 (그림 3) 젤로 DNA 샘플 (들)을로드합니다. 적절한 DNA 사이즈 마커는 항상 실험 샘플과 함께로드되어야합니다. </li><li> 겔 상자에 뚜껑을 교체합니다. 음극 (검정색 리드)는 가까이 양극 (적색 리드)보다 우물이어야합니다. 전극이 전원 공급 장치에 올바른 슬롯에 꽂혀 있는지 확인 연속. </li><li> 전원을 켭니다. 염료는 적절한 거리로 마이 그 레이션 때까지 젤을 실행합니다. </li></ol> 3. 분리된 DNA 조각을 관찰 <ol><li> 전기 영동이 완료되면 전원을 끄고 겔 상자의 뚜껑을 제거합니다. </li><li> 겔 상자에서 젤을 제거합니다. 겔의 표면으로부터 여분의 버퍼를 오프 드레인. 별도의 실행 버퍼를 흡수하기 위해 종이 타월에 젤 트레이를 놓습니다. </li><li> 겔 트레이에서 젤을 제거하고 자외선에 젤을 쉽게받을 수 있습니다. 이것은 가장 일반적으로 겔 문서 시스템 (그림 4)를 사용하여 수행됩니다. DNA 밴드가 표시됩니다최대 오렌지색 형광 밴드 등. 겔의 그림 (그림 5) 가져가라. </li><li> 적절히 겔과 기관 규제 당 실행 버퍼 처분. </li></ol> 4. 대표 결과 그림 5는 PCR 제품의 아가로 오스 겔 전기 영동 후 전형 결과를 나타냅니다. 분리 후, 결과의 DNA 조각은 명확하게 정의된 밴드로서 볼 수 있습니다. DNA를 표준 또는 사다리는 샘플 밴드의 규모에 유용한 결정을 허용 정도로 구분해야합니다. 예제 그림에서는 765 BP, 880 BP와 1022 BP의 DNA 조각은 2 로그의 DNA 사다리와 함께 1.5 % 아가로 오스 겔에 구분됩니다. <img alt="1 그림." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig1.jpg" /> 빗의 제거 후 그림 1. 경화 아가로 오스 겔. <img alt="그림 2." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig2.jpg" /> 그림 2. 학생은 그녀의 DNA 샘플을 로딩 염료를 추가. <img alt="그림 3." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig3.jpg" /> 그림 3. 겔에서 잘으로 DNA 샘플을로드하는 학생. <img alt="4 그림." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig4.jpg" /> 그림 4. 겔 문서 시스템의 예. <img alt="그림 5." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig5.jpg" /> 그림 5. 겔 포스트 전기 영동의 이미지입니다. EtBr은 1 시간 동안 100 V에서 분리 다음에 0.5 μg / ML의 최종 농도에 전기 영동 전에 겔에 추가되었습니다. 겔은 자외선과 겔 문서 시스템과 함께 찍은 사진을 접했습니다.

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	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (2001).</li><li>Kirkpatrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+agarose+gel+properties.">Overview of agarose gel properties.</a> Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).</li><li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endonuclease+R&#8226;EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis.">Analysis of endonuclease R&#8226;EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).</li><li>Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+individual+DNA+molecules+undergoing+gel+electrophoresis.">Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis.</a> Science. 243, 203-206 (1989).</li><li>Aaji, C., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+electrophoresis+of+DNA.">The gel electrophoresis of DNA.</a> Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).</li><li>Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+field+gel+electrophoresis.">Pulsed field gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 7, 34-42 (1989).</li><li>Devor, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IDT tutorial: gel electrophoresis. , (2010).</li><li>Serwer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gels:+properties+and+use+for+electrophoresis.">Agarose gels: properties and use for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).</li><li>Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+and+quaternary+structure+and+aqueous+polysaccharide+systems+which+model+cell+wall+adhesion:+reversible+changes+in+conformation+and+association+if+agarose,+carrageenan+and+galactomannans.">Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans.</a> J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).</li><li>Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+restriction+endonuclease+activities+in+H.+parainfluenzae+using+analytical+agarose-ethidium+bromide+electrophoresis.">Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis.</a> Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).</li></ol>

우리는 공개 할게 없다.

아가로 오스 겔 전기 영동은 핵산을 분리의 효율적이고 효과적인 방법으로 입증되었습니다. 아가로 오스의 높은 겔 강도는 큰 DNA 조각들의 분리를위한 낮은 비율 젤의 취급을 허용합니다. 분자 체질은 겔 매트릭스의 아가로 오스 7 번들에 의해 생성된 모공의 크기에 의해 결정됩니다. 일반적으로 아가로 오스, 작은 기공 크기의 높은 농도. 전통의 아가로 오스 젤 100 BP와 25킬로바이트 사이의 DNA 조각의 분리에 가장 효과적입니다. 25킬로바이트보다 큰 DNA 조각을 분리하려면, 하나는 두 가지 다른 방향에서 교류 전류의 적용과 관련된 펄스 필드 겔 전기 영동 6, 사용해야합니다. 이렇게 큰 크기의 DNA 조각들은 현재 방향의 변화에​​ 스스로 방향 속도로 구분됩니다. 100 BP보다 작은 DNA 조각이보다 효과적으로 polyacrylamide 겔 전기 영동을 사용하여 구분됩니다. 달리아가로 오스 젤은 polyacrylamide 겔 매트릭스는 자유 라디칼 중심의 화학 반응을 통해 형성됩니다. 이러한 얇은 젤은 높은 농도가 수직으로 실행하고 더 나은 해결책이 있습니다. 모세관 전기 영동을 시퀀싱 현대의 DNA를 사용하는에 의하여 모세관 튜브는 겔 매트릭스로 채워진다. 모세관 튜브를 사용함으로써 신속하게 DNA 조각의 분리 (와 DNA 순서의 결정) 활성화, 고전압의 적용을 허용합니다. 아가로 오스는 hydroxyethylation 통해 낮은 용융 아가로 오스를 만들 수정할 수 있습니다. 낮은 용융 아가로 오스는 일반적으로 분리된 DNA 조각의 분리가 원하는 때 사용됩니다. Hydroxyethylation 효과적으로 그들의 기공 크기 8을 감소 아가로 오스 번들의 포장 밀도를 줄여줍니다. 이것은 동일한 크기의 DNA 조각들이 같은 표준 아가로 오스 겔에 반대 낮은 용융 아가로 오스 겔을 통해 이동하는 시간이 오래 걸릴 것을 의미합니다. 번들은 서로 연관시킬 때문에그것이 설정된 후 비 공유 결합 상호 작용 9까지, 그것은 다시 녹아 아가로 오스 겔 수 있습니다. EtBr은 아가로 오스 젤 10 DNA를 착색하는 데 사용되는 가장 일반적인 시약이다. 자외선에 노출되면 ethidium 분자의 방향족 고리의 전자가 활성화되며, 이는 그라운드 상태로 전자가 리턴과 같은 에너지 (빛)의 출시로 연결. EtBr은 농도 의존적​​으로 DNA 분자에 자신을 intercalating으로 작동합니다. 이것은 강도를 토대로 특정의 DNA 밴드의 DNA의 양을 추정을 허용합니다. 워낙 긍정적인 요금 때문에 EtBr의 사용은 15 %의 DNA 마이 그 레이션 속도를 줄여줍니다. EtBr은 mutagen 용의자와 발암 물질이며, 따라서 그것을 포함하는 아가로 오스의 젤을 다룰 때 한주의 운동을해야합니다. 또한, EtBr은 유해 폐기물로 간주되어 적절하게 폐기해야합니다. 아가로 오스의 젤의 DNA에 대한 대체 얼룩 SYBR 골드, SYBR 녹색, 크리스탈 바이올렛과 ​​메틸 블루를 포함합니다. 이 중,메틸 블루와 크리스탈 바이올렛 젤의 DNA 조각의 복구가 필요한 경우에는이를 돌연변이의 가능성을 줄이고, DNA 밴드의 시각화를위한 자외선에 젤의 노출을 요구하지 않습니다. 그러나, 그들의 감성은 EtBr보다 낮은 있습니다. SYBR 금, SYBR 녹색 EtBr보다 낮은 독성으로 모두 매우 민감한, UV 염료에 의존하지만, 그들은 상당히 더 비쌉니다. 또한, 대체 염료의 모든 수 없습니다 하나 또는 겔에 직접 추가할 때 잘 작동하지 않으므로 겔은 전기 영동 후 게시물 스테인드 있어야합니다. 때문에 비용, 사용의 용이성, 그리고 감성, EtBr 아직도 많은 연구자에 대한 선택의 염료 남아 있습니다. 그러나 이러한 유해 폐기물 처리가 어렵거나 할 때 어린 학생 때 등 특정 상황에서 실험을 수행하고, 덜 독성 염료가 선호 수 있습니다. 겔 전기 영동에 사용되는 로딩 염료 세 가지 주요 목적. 먼저 그들은 샘플에 밀도를 추가그게 젤 밑으로 가라앉을 수 있도록했습니다. 둘째, 염료는 색상을 제공하고 로딩 프로세스를 단순화합니다. 마지막으로, 염료는 DNA 조각들이 마이 그 레이션되었는지 거리의 추정​​ 수있게 겔을 통해 표준 속도로 이동합니다. 분리된 DNA 조각의 정확한 크기는 각 밴드에 의해 여행 거리에 대한 DNA 검사 표준의 각 밴드에 대한 분자량의 로그를하려 의해 결정됩니다. 유전자 표준은 미지의 유전자 샘플을 비교하실 수 있습니다 미리 정해진 크기의 DNA 조각의 혼합되어 있습니다. 그것은 DNA의 다양한 형태가 다른 속도로 젤을 통해 이동합니다 것이 중요합니다. Supercoiled 플라스미드 DNA는 워낙 컴팩트한 형태 중에 가장 느린 여행 오픈 둥근 형태와 같은 크기의 선형의 DNA 조각, 다음, 빠른 젤로 이동합니다. 결론적으로 DNA의 분리를위한 1970 년대의 아가로 오스 젤의 채택 이후, 지금까지생물 과학 연구에서 가장 유용하고 다재 다능한 기술 중 한 명이라고 증명.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 아가로 오스 나 </td><td> Amresco </td><td> 0710 </td><td></td></tr><tr><td> 붕산 </td><td> 시그마 </td><td> B7901 </td><td></td></tr><tr><td> Bromophenol 블루 </td><td> 시그마 </td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 시그마 </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> Ethidium 브로마이드 </td><td> 시그마 </td><td> E7637 </td><td> 유해 폐기물로 폐기되는 발암성 - 필요 </td></tr><tr><td> 빙초산 </td><td> 어부 </td><td> BP2401-212 </td><td> 부식성의 </td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td> 어부 </td><td> G33-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xylen전자 cyanol FF </td><td> 시그마 </td><td> X4126 </td><td></td></tr><tr><td> 트리스베이스 </td><td> 시그마 </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> 조사 / FX 겔 문서 시스템 </td><td> Fotodyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 올빼미 Easycast B1 미니 겔 전기 영동 시스템 </td><td> 써모 과학 </td><td> B1-PTM </td><td></td></tr><tr><td> EPS 301 전원 공급 장치 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

agarose gel electrophoresis for the separation of dna fragments

아가로 오스 겔 전기 영동은 100 BP의 25킬로바이트 1에 이르는 다양한 크기의 DNA 조각을 분리하는 가장 효과적인 방법입니다. 아가로 오스는 해초 장군 Gelidium 및 Gracilaria으로부터 격리하고, 반복 agarobiose (L-및 D-갈락토 오스) subunits이 구성되어 있습니다. 겔화 동안 아가로 오스의 폴리머가 아닌 covalently 연결 및 기공 크기 겔의 분자 체질 속성을 결정하는 번들의 네트워크를 형성합니다. 아가로 오스 겔 전기 영동의 사용은 DNA의 분리를 혁명. 아가로 오스 젤의 채택 이전에 DNA가 주로에만 크기의 근사치를 제공 자당 밀도 구배 원심 분리를 사용하여 분리되었다. 아가로 오스 겔 전기 영동을 사용하여 DNA를 분리하기 위해 DNA가 젤과 현재 응용의 프리 캐스트 우물에로드됩니다. DNA를 (그리고 RNA) 분자의 인산 백본은 부정적인 전기장에 배치하면 따라서 부과되는 유전자 조각 p로 마이 그 레이션됩니다ositively 양극 부과. DNA가 균일한 질량 / 전하 비를 가지고 있기 때문에, DNA 분자가 여행한 거리는 분자량 3 로그에 반비례한다는 그러한 패턴에 아가로 오스 겔 내에서 크기로 구분됩니다. 아가로 오스 겔을 통해 DNA의 움직임을 위해 선도적인 모델은 최첨단 앞으로 이동과 4를 따라 분자의 나머지를 가져옵니다 의하여 &quot;reptation을 편견&quot;입니다. 2) 아가로 오스 농도, 3) DNA의 형태 5; 4) ethidium 브로마이드 6의 전압을 적용, 5)의 존재) 종류의 DNA 분자의 1) 크기 : 겔을 통해 DNA 분자의 마이 그 레이션 율에 따라 결정됩니다 아가로 오스와 7) 전기 영동 버퍼의. 분리 후의 DNA 분자는 적당한 색소를 더럽히는 것 후에는 자외선 아래에서 시각 될 수 있습니다. 이 프로토콜에 따라, 학생들은 수 있어야합니다 : <ol><li> 디엔에이 조각 겔 매트릭스 내에 구분하는 메커니즘을 이해 </li><li> 의 형태 방법을 이해DNA 분자는 겔 매트릭스를 통해 이동성을 결정합니다 </li><li> 그들의 요구에 적절한 농도의 아가로 오스 솔루션을 식별 </li><li> DNA 샘플의 전기 영동을위한 아가로 오스 겔 준비 </li><li> 겔 전기 영동 장치 및 전원 공급 장치를 설정 </li><li> 의 DNA 조각의 분리에 적합한 전압을 선택 </li><li> ethidium의 브로마이드가 DNA 밴드의 시각화을 허용하는 메커니즘을 이해 </li><li> 분리된 DNA 조각의 크기를 결정 </li></ol>

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Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

아가로 오스 겔 전기 영동을 이용한 DNA 조각의 분리를위한 기본적인 프로토콜이 설명되어 있습니다.

의 DNA 조각의 분리를위한 아가로 오스 젤 전기 영동

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

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Research

JoVE Journal

Biology

759.8K 조회수.  University of California Los Angeles. 아가로 오스 겔 전기 영동을 이용한 DNA 조각의 분리를위한 기본적인 프로토콜이 설명되어 있습니다.

비디오: Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Okay.Hi, my name is Celeste Peterson and I'm a fellow at Harvard University studying microbial bio film communities. So I am profiling the bacterial communities by looking at their 60 N sequence and how this sequence changes over time in space. And to do that, I'm using DDGE.This is not a normal acry of my well, it needs to be kept at 60 degrees when it's run and the buffer needs to be pumped continuously. So we're gonna warm up the buffer for about an hour until it's at 60 degrees, and then we can run the towel. Now I'm gonna wash this plate with dilute uc solution, peeling around for impurities, andone, light that up.Anything like that can cause regularities. It is important to wipe off all the water. So when I assemble the gel, I'll put that chip on the outside of the gel.So the gel will be in between these two pieces of glass and the chip will be on the outside and it won't affect the gel in between. So now I'm gonna assemble the gel in these clamps and then I squeeze them together and tighten by turning to the right. As with any gel, it's important to make sure that the bottom is flush.To prevent making, we now turn the gel around and put it in here to get sealed with the gasket. So it's important when you do this that the gel, that the plates are actually lined up with the gasket here. So these knobs on the side then go in and you press down to type the seal.So this is a 30 mil syringe. And this part and this part come with the bio red kit and it just on like this. And that's just to get rid of the excess water in the tubes.So put the tubing onto the gel to load the gel. First you put an adapter into the tubing and then a needle look with that small adapter and put it right in the center of the gel just so it's fairly below the bottom glass. Then this wire adapter goes into the long tubing and it's going to connect to equal syringes containing the high and the low density solution.So these are pre-prepared solutions. The blue one, I've added a dye here that just indicates that this is the most denaturing solution and this is the least fitting train solution, the low density one. And they have everything in them.And now I'm gonna to make, gonna be Actually I twice as much the week. And once you've got the tempt, you have about five to seven minutes to fill the gel before the colon rises. And now we fill the syringe juice with the solution.So I'm gonna fill it with about 15 the solution. And then to get rid of any air bubbles, I'll turn it upside down and squeeze gently until that top air bubble is gone. Now this little screw here is gonna go into this groove.This adapter is gonna line up with this clamp here, and it's gonna get C clamped in very tightly. And then this tubing is gonna attach to the syringe. And the same thing is done on the other side with the high density matrix where it's time to deliver.And so I'm gonna be turning this wheel in a steady clockwise motion. And first the blue solution is gonna go out first because that's the the most in nature, and it's gonna form the bottom part of the gel. And then after a little while, the clear solution will start filling in the gel and the Gradient will be formed.One moment is the gently on an angle to And as soon as you finish pouring the gel to wash out your tubes immediately because they will polymerize Going, It's the group there. And then press down. So this little, And on the other side, I'll do the same thing.Okay.Hi, my name is Celeste Peterson and I'm a fellow at Harvard University studying microbial bio communities. So I am profiling the bacterial communities by looking at their 60 F sequence and how the sequence changes over time in space. And to do that, I'm using DDGE.So DGE is Dena gel electrophoresis. And basically the idea is that there's a gradient and the DNA, as it runs down the gradient gets de natured. And so different 16 species will stop at different points along the gradient.And so it ends up being a fingerprint of the different sexiness species in the community. So the goal of my experiment is to see who is in the community and how that's changing over time and space. And I can run the sexiness DDD gel and then I can cut out the bands and identify the species that are represented in each community.So one of the biggest issues when, when doing A DDG gel is to figure out the gradient that's the best. And so that is just something that needs to be played around with and figuring out for a particular community which type of gradient. So the one I'm using today is 35 to 55%urea.One of the big problems that can happen with this technique is that smears come up in in the leans. And I found for that, for whatever reason, one of the best things to do is to run the gels for a really long time and then the smears disappear. Well, today I'm just using it for general bacterial communities, but this can also be used for a specific family of bacteria to see how those change over time, and those tend to be very clean gels.You can also look at mutations in single genes with DDGE.

Denaturing 그라디언트 젤 전기 영동 (DGGE)

연구

생물학

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

Angiogenesis 연구에 최적화된 섬유소 젤 비드 분석

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

아가로 오스 겔 기반 Microfluidic 장치를 사용 신경 줄기 세포의 운동성 평가

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are conformationally self-templating proteins that are thought to have beneficial roles in lower organisms.  Amyloids have been notoriously difficult to study due to their insolubility and structural heterogeneity.  However, resolution of amyloid polymers based on size and detergent insolubility has been made possible by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis (SDD-AGE).  This technique is finding widespread use for the detection and characterization of amyloid conformational variants.  Here, we demonstrate an adaptation of this technique that facilitates its use in large-scale applications, such as screens for novel prions and other amyloidogenic proteins.  The new SDD-AGE method uses capillary transfer for greater reliability and ease of use, and allows any sized gel to be accomodated.  Thus, a large number of samples, prepared from cells or purified proteins, can be processed simultaneously for the presence of SDS-insoluble conformers of tagged proteins.

SDD-AGE is a useful technique for the detection and characterization of amyloid-like polymers in cells. Here we demonstrate an adaptation that makes this technique amenable to large-scale applications.

세미 Denaturing 세제 - 아가로 오스 젤 전기 영동에 의해 아밀로이드 집계에 대한 심사

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their separation in a polyacrylamide gel matrix based on the molecular weight. Fragments between 2 to 500 bases, with length differences as small as a single nucleotide, can be separated using this method1. The migration of the sample is dependent on the chosen acrylamide concentration. A higher percentage of polyacrylamide resolves lower molecular weight fragments. The combination of urea and temperatures of 45-55 &deg;C during the gel run allows for the separation of unstructured DNA or RNA molecules.
In general this method is required to analyze or purify single stranded DNA or RNA fragments, such as synthesized or labeled oligonucleotides or products from enzymatic cleavage reactions.
In this video article we show how to prepare and run the denaturing urea polyacrylamide gels. Technical tips are included, in addition to the original protocol 1,2.

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis is used to separate single-stranded DNA or RNA up to a limit of 500 nucleotides. Urea in combination with heat denatures samples and unstructured single strands migrate within the gel matrix according to their molecular weight.

Denaturing 요소의 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (우레아 페이지)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Electroeluting DNA Fragments

Purified DNA fragments are used for different purposes in Molecular Biology and they can be prepared by several procedures. Most of them require a previous electrophoresis of the DNA fragments in order to separate the band of interest. Then, this band is excised out from an agarose or acrylamide gel and purified by using either: binding and elution from glass or silica particles, DEAE-cellulose membranes, "crush and soak method", electroelution or very often expensive commercial purification kits. Thus, selecting a method will depend mostly of what is available in the laboratory. The electroelution procedure allows one to purify very clean DNA to be used in a large number of applications (sequencing, radiolabeling, enzymatic restriction, enzymatic modification, cloning etc). This procedure consists in placing DNA band-containing agarose or acrylamide slices into sample wells of the electroeluter, then applying current will make the DNA fragment to leave the agarose and thus be trapped in a cushion salt to be recovered later by ethanol precipitation.

This procedure allows the purification of DNA fragments with high yield.

DNA 조각을 Electroeluting

Purified DNA fragments are used for different purposes in Molecular Biology and they can be prepared by several procedures. Most of them require a ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

셀룰러 Lysates에서 Multiprotein의 단지의 분석을 위해 블루 기본 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (BN - PAGE)

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types and is widely believed to be directly associated with the development of cancer in humans. DNA damage, such as that induced by UV irradiation, severely impairs the ability of replication to duplicate the genomic template accurately. A number of gene products have been identified that are required when replication encounters DNA lesions in the template. However, a remaining challenge has been to determine how these proteins process lesions during replication in vivo. Using Escherichia coli as a model system, we describe a procedure in which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structural intermediates that arise on replicating plasmids in vivo following UV-induced DNA damage. This procedure has been used to demonstrate that replication forks blocked by UV-induced damage undergo a transient reversal that is stabilized by RecA and several gene products associated with the RecF pathway. The technique demonstrates that these replication intermediates are maintained until a time that correlates with the removal of the lesions by nucleotide excision repair and replication resumes.

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

We present a procedure by which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structure of replication intermediates that occur following UV irradiation.

에서 UV - 유도 복제 중간체의 시각화 E. 대장균 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석을 사용하여

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID-SEQ : 아데닌 - 메틸화 된 DNA 단편의 높은 처리량 시퀀싱에 의해 단백질 DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...