우리는 1 차원 젤의 준비와 얼룩에 대한 박사 니콜라 Wiethölter 감사합니다. 이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (ND와 SM에 GRK 1089/project 5)에서 부여로 투자 및 ND에 Stiftung 위르겐 만촛에서 연구 활동에 의해 지원되었다.

1 부 : 컵 로딩을 사용하여 2 차원 (2 - D) 겔 전기 영동 <ol><li> IPG - 스트립 rehydration과 isoelectric 초점 (IEF) <ul><li> 125 μl rehydration 솔루션의 Immobiline의 DryStrip의 젤, 산도 6-11을 (7cm) Rehydrate [7 M 우레아, 2 M 티오 우레아, 4 % 챕스, 버퍼 산도 6-11을 IPG 50 MM의 hydroxyethyldisulfide 2 %]에 대한 Immobiline DryStrip Reswelling 트레이를 사용하여 적어도 10 시간. </li><li> IEF 샘플 버퍼 시켰던 단백질 샘플을 디졸브 [7 M 우레아, 2 M 티오 우레아, 2 % 챕스, 2% 버퍼 산도 6-11 IPG ASB - 14, 50 MM의 hydroxyethyldisulfide 2 %] 100 μl 당 60-100 μg의 단백질에 대응을 . </li><li> solubilization (상온에서 최소 30 분) 후, 샘플 컵을 사용하여 컵 로딩 양극을 통해 단백질 샘플을 적용합니다. 컵의 볼륨은 100 μl입니다 (매니폴드 컵 150 μl까지 허용). 참고 : 컵에 액체 필름 아직 거기있는 동안 당신이 초점을 프로토콜과 리필 종이컵의 시작 부분에서 낮은 전압 단계를 삽입하는 경우가 더 큰 예제 금액을 로드할 수 있습니다! </li><li> Multiphor II 전기 영동 단위의 기울기 모드에서 11.1 kVh에 대한 초점을 isoelectric을 수행합니다. </li></ul></li><li> 평균 및 SDS - PAGE <ul><li> IEF 후, I​​PG 스트립은 평균 솔루션에 각각 1 % dithiothreitol과 2.5 %의 iodoacetamide를 사용하여 쉐이크에 대한 때마다, 감소와 알킬화 15 분 대상이되었다 [50 MM Tris-HCl/pH 8.8, 6 M 우레아, 30 % 글리세롤 그리고 2% SDS]. </li><li> H 2 O와 equilibrated 스트립을 씻어 초과 평형의 버퍼를 제거하는 왓먼 종이에 그들을 얼룩. 이후 SDS 실행 버퍼 (1X)에 부착된을 찍어. </li><li> 두 번째 차원은 12 %의 총 아크릴 아미드의 농도와 수직 전기 영동 시스템에 대한 SDS - PAGE에 의해 수행됩니다. equilibrated IPG 스트립이 분리 젤의 상단에 위치하고 뜨거운 아가로 오스 솔루션 [bromophenol 블루가 포함된 버퍼 실행에 0.5 % 아가로 오스]를 함께 해결되었습니다. </li><li> 단백질은 염료 전면 겔 카세트의 바닥에 도달할 때까지 120 V 다음에 15 분 동안 80 V에서 시작, 2.5 시간을 위해 분리되었다. </li></ul></li></ol> 2 부 : CBB G - 250로 콜로이드 쿠매시의 염색법 1. 얼룩 솔루션 참고 : Millipore 시스템 (밀리 Q 물)에서 얻을로 얼룩 솔루션의 준비를 위해 이러한 분석 학년 (PA) 및 고순도의 물 같은 높은 품질의 화학 물질을 사용합니다. <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 쿠매시 솔루션 : </td><td> 광고 2000 ML H 2 O </td></tr><tr><td> 0.02 % (W / V) </td><td> CBB G - 250 </td><td> 0,4 g </td></tr><tr><td> 5 % (W / V) </td><td> 황산 알루미늄 - (14-18) 수화물 </td><td> 100g </td></tr><tr><td> 10 % (V / V) </td><td> 에탄올 (96 %) </td><td> 200 ML </td></tr><tr><td> 2퍼센트 (V / V) </td><td> orthophosphoric 수 소산​​ (85 ​​%) </td><td> 47 ML </td></tr></tbody></table> 참고 : 얼룩 솔루션의 준비를 위해, 다음과 같은 순서로 구성 요소의 연속적인 덧셈 유지되어야합니다 : <ol><li> 첫째 밀리 Q 물에 황산 알루미늄을 풀다 </li><li> 이후, 에탄올을 추가 균질하고 솔루션에 CBB G - 250 믹스 </li><li> 솔루션이 완전히 해소에 버금가는 최근, 인산을 (알코올 미디어 산성의 결합들은 콜로이드 상태로 집계 쿠매시 분자를 수) 추가 </li><li> 결국 밀리 Q의 물을 채워 </li></ol> 참고 : 최종 얼룩 솔루션은 어두운 녹색 푸른빛이 도는 모양을 가지고 있으며, 주변에 수영 입자 가득합니다 : <ul><li> 여과액이 솔루션은하지 마! </li><li> 이 준비의 순서를 변경하는 경우, 당신은 덜 민감보다 바이올렛 - 푸르스름한 솔루션을 얻을 것입니다. </li></ul><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 솔루션을 Destaining : </td><td> 광고 2000 ML H 2 O </td></tr><tr><td> 10 % (V / V) </td><td> 에탄올 (96 %) </td><td> 200 ML </td></tr><tr><td> 2퍼센트 (V / V) </td><td> orthophosphoric 수 소산​​ (85 ​​%) </td><td> 47 ML </td></tr></tbody></table> 2. 절차를 염색법 <ul><li> 두번째 차원 분리 후, 조심스럽게 유리 접시에서 젤류를 제거하고 밀리 Q 물로 가득 얼룩 그릇에 그들을 전송합니다. </li><li> 수평 흔드는 (젤에 남아있는 SDS는 단백질에 대한 염료의 경계를 방해하기 때문에 부족한 세탁은 가난한 감도의 원인)에 10 분간 밀리 Q 물로 젤 세 번 씻으십시오. </li><li> 고르게 콜로이드 입자를 분산하는 데 사용하기 전에 쿠매시 솔루션을 흔들어. </li><li> 잘 2~12시간 위해 쉐이크에 교반하여 쿠매시 솔루션으로 덮여 젤을 품어. 이 사이에있는 얼룩의 진행 상황을 볼 수 있도록이 얼룩은 한계 배경을 생성합니다. 참고 : 10 분 후 먼저 단백질의 명소가 부화 2 시간 이내에, 그것에 얼룩 약 80 %를 게재 볼 수 있습니다S 최대 레벨이 완료됩니다. 거의 100 % 얼룩 경우, 하룻밤 배양하는 것이 좋습니다. 어떤 경우에는 스테인드하는 단백질의 양이 거대하며 솔루션은 밝은 청색으로 변하기 때, 얼룩 솔루션의 새로 고침이 필요합니다. </li><li> 얼룩 절차 후 쿠매시 솔루션을 제거하고 밀리 Q 물로 두 번 젤을 씻어. 참고 : 입자가 아직 남아 있으므로이 한 얼룩 솔루션을 재사 용할 수, 그렇지 않으면 (귀하의 연구실은 폐기물 처리에 대한 특별한 규정이있을 수 있습니다 것을 명심하십시오)를 폐기하십시오. </li><li> 보푸라기가없는 종이 타월로 얼룩 접시에서 염료 입자를 집어넣는 제거하고 10 destain - 60 분. 참고 : 또한 단지 밀리 Q 물로 젤을 씻을 수 있지만 스캔 절차를 수행하는 동안 발생할 것입니다 젤에 불규칙적인, 약한 쿠매시 필름이 지난 있기 때문에 이것은 우리가 예비 젤에 대해서만하는 것이 좋습니다. </li><li> 마지막으로 밀리 Q 물로 두 번 씻어 젤 : 젤 원래 두께에 도달 (알코올 산성 미디어 젤의 축소를 만드는)와 중화 물 속에서 또한 쿠매시의 색상 강도를 향상됩니다. </li></ul> 파트 3 : 대표 결과 당신은 위에서 설명한 프로토콜을 따른다면 당신은 2 - D 젤 특유의 해결을 잘 스테인드 진한 파란색 단백질 명소에 얻을 것이다. 심지어 쉐브첸코 외. 5, 질량 분광법과 좋은 감도와 호환성을 주장하는 프로토콜에 따라 은색 물들일 2 - D 겔에 비해, 우리는 동등한 얼룩 결과를 얻을 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1431/fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 : 위에서 설명한 실험의 최종 결과. 강의 쿠매시 프로토콜 (A)는 쉐브첸코 외에 따라 은빛 얼룩처럼 강력하게 수행합니다. (B) 2 - D 겔 전기 영동 후 단백질을 검출 인치 부 4 : 팁 및 유용한 정보 <ul><li> 자신의 샘플을 처리하기 전에 몇 가지 테스트 stainings을 수행합니다. 설명할 이유로 우리는 밀리그램이 적용되었습니다 때에도 관심의 단백질이 성공적으로 감지되지 않을 수 가끔 보도했다. 이 경우에는 우리는 감도를 테스트하는 몇 가지 희석 시리즈를 준비하는 것이 좋습니다. </li><li> 당신은 SDS - PAGE 동안 분리 겔에 스태킹에서 일반적으로 실패 전송의 단백질 인 겔 감지 (들)을 낮은이있다면 아마도 그 이유 것입니다. 당신은 스태킹 지역을 포함한 전체 젤 얼룩하여 이러한 끈적끈적한 단백질에 대한 확인하실 수 있습니다. </li><li> 귀하의 isoelectric 초점 결과의 빠른 확인을 위해, 당신은 바로 더 둘째 차원 분리하지 않고 IPG - 스트립을 얼룩 수 있습니다. </li><li> 그들은 (당신이 젤은 냉정한 유지하면 염료 그냥 젤의 한쪽에 바인딩) 양쪽에서 균등하게 스테인드하므로 때때로 얼룩 절차를 수행하는 동안 젤을 켜십시오. </li><li> 우리는 그 어두운 병에 얼룩 솔루션 스토리지 (4 개월 최대 투명 병에)의 수명을 증가가 발생했습니다. </li><li> 얼룩 및 (가 산성 솔루션을 추가하는 경우가 곰팡이에 의해 contaminations을 피할) 몇 년 동안 냉장고에 젤을 유지할 수 문서화 후. </li><li> tryptic 다이제스트에 대한 겔 플러그의 Destaining은 블록 히터의 온난화에 의해 가속 수 있습니다. </li></ul>

<ol>
	<li>Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+new+staining+procedures+for+quantitative+estimation+of+proteins+on+electrophoretic+strips.">Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips.</a> Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).</li><li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250.">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).</li><li>Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+Silver:+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis.">Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).</li><li>Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+and+Fast+Protein+Detection+with+Coomassie+Brilliant+Blue+in+Sodium+Dodecyl+Sulfate-Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis.">Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).</li><li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels.">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).</li></ol>

혁신 아니면 그냥 다른 쿠매시 프로토콜? 현재 쿠매시 브릴리언트 블루와 절차를 얼룩에 대해 여러 개의 프로토콜이 존재. 그들의 대부분은 Neuhoff 및 동료 2에서 가장 일반적으로 사용되는 프로토콜 중 하나의 미성년자 또는 대대적인 개조로 인한. 또한 강의 프로토콜은 Neuhoff의 공식에 따라. 하지만 정말 proteomic 연구에 대안 쿠매시의 얼룩 방법인가요? 우리는 다른 ?...

<table border="1" ><tr><td> 제품 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> : IEF와 SDS - PAGE에 대한 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip 젤 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 17-6001-94 </td><td> 심지어 날짜 만료 2 년후 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Reswelling 트레이 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 80-6371-84 </td><td> 유기 용제와 함께 세척하지 마십시오. 7-18센티미터 IPG - 부착된를 위해 마련되었습니다. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip 키트 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 18-1004-30 </td><td> 트레이, 전극 홀더, 양극과 음극 전극, aligner과 샘플 컵 표시줄과 샘플 컵을 포함합니다. </td></tr><tr><td> EPS 3501 XL 전원 공급 장치 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 18-1130-05 </td><td> 용품 3,500 최대 전압 V. </td></tr><tr><td> Multiphor II 전기 영동 단위 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 18-1018-06 </td><td> 가동 전극은 모든 길이의 IPG 스트립에서 IEF를 활성화 (7-24센티미터가 스트립을 IPG) </td></tr><tr><td> PerfectBlue 젤 시스템 트윈 S </td><td> Peqlab </td><td> 45-1010 - C </td><td> 10x10 cm 미니 젤 형식의 SDS - PAGE. 젤 챔버는 냉각 시스템이 포함되어 있습니다. </td></tr><tr><td> : 콜로이드 쿠매시 G - 250 염색법에 대한 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 뚜껑과 함께 요리를 염색법 </td><td> VWR </td><td> 216-3412 </td><td> 미니 젤에 대한 힘드 네요. 쉐이크에 Stackable. </td></tr><tr><td> 알루미늄 황산 - 18 - 하이드 레이트 </td><td> 머크 </td><td> 1.01102.5000 </td><td> 우리는 머크와 함께 최고의 경험을했다. 5kg 패키지에 단지 가능합니다. </td></tr><tr><td> orthophosphoric 수 소산 </td><td> Prolabo </td><td> 20 624.295 </td><td> 유리병에서 판매. </td></tr></table>

fast and sensitive colloidal coomassie g-250 staining for proteins in polyacrylamide gels

쿠매시 블리언트 블루 (CBB)은 일반적으로 간단한 얼룩 절차 및 높은 quantitation를 제공 SDS - PAGE로 구분하여 단백질의 시각화에 사용되는 염료입니다. 또한, 그것은 대량 spectrometric 단백질 식별와 완벽하게 호환됩니다. 그러나 이러한 장점에도 불구하고, CBB는 은색 또는 형광 stainings보다 민감하고 따라서 분석 젤 기반 proteomic 접근에서 단백질의 검출에 사용되는 거의 없습니다 것으로 간주된다. 원래 쿠매시 프로토콜 1 몇 가지 개선 CBB의 감도를 증가되었습니다. 두 대대적인 개조가 콜로이드 입자로 염료 분자를 변환하여 낮은 풍부한 단백질의 검출을 향상시키기 위해 도입되었습니다 : 1988 년, Neuhoff와 동료는 CBB G - 250을 기반으로 얼룩 솔루션 2에 20 % 메탄올 및 암모늄 황산의 높은 농도를 적용 2004 Candiano 외 인치 암모늄 황산과 메탄올 3의 존재에있는 인산과 CBB G - 250을 사용하여 블루 실버를 설립하였습니다. 그럼에도 불구하고, 모든 수정은 약 10 NG 단백질의 검출을 허용합니다. 콜로이드 쿠매시의 얼룩에 대해 광범위하게 fameless 프로토콜은 강 외에 의해 출판되었다. 2002 년 그들은 complexing 물질에 관한 Neuhoff의 콜로이드 CBB의 얼룩 프로토콜을 수정 곳. 대신 암모늄 황산의 그들은 황산 알루미늄과 메탄올이 적은 독성 에탄올 4로 대체되었다를 사용합니다. 소설 알루미늄 기반의 강호의 연구에 얼룩이 약간 감도 유사 단백질에 따라 1 NG / 밴드 (phosphorylase B)처럼 낮은 감지 우수한 감도를 보여주었다. 여기서는 분석 목적에 단백질의 신속하고 민감한 콜로이드 쿠매시의 얼룩을 위해 강호의 프로토콜의 응용 프로그램을 보여줍니다. 우리는 일상적으로 우리의 작업 그룹에서 수행 2 차원 젤을 사용하여 빠르고 쉽게 프로토콜을 설명합니다.

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Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

이 동영상은 강호에 따라 콜로이드 쿠매시 G - 250 얼룩 프로토콜을 대중화한다<em&gt; 외.</em&gt; 젤 평균 4 NG 단백질의 검출을위한. 얼룩은 2 시간 이내에 어떠한 노력도없이 ​​완료됩니다. 우리는 일상적으로 젤 기반 proteomics의 분석을 위해 강호의 프로토콜을 사용합니다.

Polyacrylamide의 젤의 단백질에 대한 신속하고 민감한 콜로이드 쿠매시 G - 250 스테 이닝

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

40.1K 조회수.  University Duesseldorf. 이 동영상은 강호에 따라 콜로이드 쿠매시 G - 250 얼룩 프로토콜을 대중화한다 외. 젤 평균 4 NG 단백질의 검출을위한. 얼룩은 2 시간 이내에 어떠한 노력도없이 ​​완료됩니다. 우리는 일상적으로 젤 기반 proteomics의 분석을 위해 강호의 프로토콜을 사용합니다.

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Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

젤의 단백질 염색법

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

연구

생물학

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their separation in a polyacrylamide gel matrix based on the molecular weight. Fragments between 2 to 500 bases, with length differences as small as a single nucleotide, can be separated using this method1. The migration of the sample is dependent on the chosen acrylamide concentration. A higher percentage of polyacrylamide resolves lower molecular weight fragments. The combination of urea and temperatures of 45-55 &deg;C during the gel run allows for the separation of unstructured DNA or RNA molecules.
In general this method is required to analyze or purify single stranded DNA or RNA fragments, such as synthesized or labeled oligonucleotides or products from enzymatic cleavage reactions.
In this video article we show how to prepare and run the denaturing urea polyacrylamide gels. Technical tips are included, in addition to the original protocol 1,2.

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis is used to separate single-stranded DNA or RNA up to a limit of 500 nucleotides. Urea in combination with heat denatures samples and unstructured single strands migrate within the gel matrix according to their molecular weight.

Denaturing 요소의 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (우레아 페이지)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

Cardiomyocytes의 빠른 칼슘 Fluxes 측정

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

민감한, 대규모 양적 대사 체학을위한 전략

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

배양 된 HL-1 심방 근육 세포 단층의 전압 및 칼슘 듀얼 채널 광학 매핑

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to differentiate the myoglobin (Mb) of cetaceans from that of seals and other animals. The strip provides rapid and on-the-spot screening for cetacean meat, thereby restraining its illegal trade and consumption. Two monoclonal antibodies (mAbs) with reactivity toward the Mb of cetaceans were developed. The amino acid sequences of Mb antigenic reactive regions from various animals were analyzed in order to design two synthetic peptides (a general peptide and a specific peptide) and thereafter raise the mAbs (subclass IgG1). The mAbs were selected from hybridomas screened by indirect ELISA, western blot and dot blot. CGF5H9 was specific to the Mbs of rabbits, dogs, pigs, cows, goats, and cetaceans while it showed weak to no affinity to the Mbs of chickens, tuna and seals. CSF1H13 can bind seals and cetaceans with strong affinity but showed no affinity to other animals. Cetacean samples from four families (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae and Kogiidae) were used in this study, and the results indicated that these two mAbs have broad binding ability to Mbs from different cetaceans. These mAbs were applied on a sandwich-type colloidal gold immunochromatographic test strip. CGF5H9, which recognizes many species, was colloid gold-labeled and used as the detection antibody. CSF1H13, which was coated on the test zone, detected the presence of cetacean and seal Mbs. Muscle samples from tuna, chicken, seal, five species of terrestrial mammals and 15 species of cetaceans were tested in triplicate. All cetacean samples showed positive results and all the other samples showed negative results.

This protocol describes the development of two IgG class monoclonal antibodies (mAbs) strongly reactive to myoglobin of cetaceans. These mAbs are applied on a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format to differentiate the Mb of cetaceans from seal and other animals.

고래 마이오글로빈의 검출을위한 콜로이드 골드 기반 면역 크로마토 그래피 테스트 스트립의 개발

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

민감한 면역를 사용하여 시토신의 수정 된 형태의 검출

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.

인간 뇌 조직에서 단백질의 다중 반응 모니터링 기반 검출을 이용한 정량적 프로테오믹스 워크플로우

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role in a variety of basic biological structures and processes. As polymers, GAGs exist as a polydisperse mixture containing polysaccharide chains that can range from 4000 Da to well over 40,000 Da. Within these chains exists domains of sulfation, conferring a pattern of negative charge that facilitates interaction with positively charged residues of cognate protein ligands. Sulfated domains of GAGs must be of sufficient length to allow for these electrostatic interactions. To understand the function of GAGs in biological tissues, the investigator must be able to isolate, purify, and measure the size of GAGs. This report describes a practical and versatile polyacrylamide gel electrophoresis-based technique that can be leveraged to resolve relatively small differences in size between GAGs isolated from a variety of biological tissue types.

This report describes techniques to isolate and purify sulfated glycosaminoglycans (GAGs) from biological samples and a polyacrylamide gel electrophoresis approach to approximate their size. GAGs contribute to tissue structure and influence signaling processes via electrostatic interaction with proteins. GAG polymer length contributes to their binding affinity for cognate ligands.

폴리아크릴아미드 젤 전기포및 은 염색에 의한 글리코아미노글리칸 검출

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...