당사의 제브라피쉬 간암 모델과 프로토콜은 생체 내 현미경을 사용하여 생체 내, 비침습적으로 간 미세 환경과 면역 환경을 시각화할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 제브라 피쉬 유충의 투명성은 의심 할 여지없이이 시스템의 주요 장점으로, 비 침습적 생체 내 현미경 검사를 수행하고 간과 같은 깊은 조직 및 기관의 미세 환경 및 면역 세포 침투에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 우리의식이 유도 신 모델과이 프로토콜에 설명 된 이미징 기술은 대사 증후군 및 심혈관 질환을 포함한 다른 간 질환 또는 연구 분야의 복잡한 세포-세포 상호 작용에 쉽게 적용될 수 있습니다.
이 절차를 시연하는 것은 실험실 기술자 인 Cassia Michael과 내 실험실의 박사후 연구원 인 Francisco Juan Martinez-Navarro 박사가 될 것입니다. 시작하려면 제브라 피쉬 유충을위한 상업용 건조 식품 식단 4g을 25 밀리리터 유리 비커 2 개에 달아 하나는 일반 식단 용이고 다른 하나는 10 % 고 콜레스테롤 식단 (HCD)입니다. 10 밀리리터 유리 비커에 0.4g의 콜레스테롤을 달고 비커를 호일로 덮으십시오.
흄 후드에서 20 게이지 바늘이 달린 10 밀리리터 주사기를 사용하여 5 밀리리터의 디 에틸 에테르를 측정하십시오. 그런 다음 일반 다이어트 비커에 디 에틸 에테르를 넣고 주걱을 사용하여 즉시 건조 식품과 혼합하십시오. 동일한 주사기와 바늘을 사용하여 5 밀리리터의 디 에틸 에테르를 측정하고 HCD 함유 비커에 첨가하십시오.
주사기로 위아래로 흡인하여 즉시 혼합하십시오. 콜레스테롤 용액을 HCD 비커에 빠르게 넣고 용액이 균일해질 때까지 주걱과 즉시 혼합하십시오. 비커를 후드에 최대 24시간 동안 그대로 두어 디에틸 에테르를 완전히 증발시키십시오.
다음날, 유봉과 박격포를 사용하여 다이어트를 미세 입자로 분쇄하십시오. 각 식단을 라벨이 붙은 작은 비닐 봉지 또는 50 밀리리터 원심 분리기 튜브에 옮기고 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 1 일에서 1 일을 뺀 날에 형질 전환 물고기 줄을 설정하십시오.
0 일째에는 물고기가 산란 한 후 메쉬 스트레이너에 알을 모으십시오. E3가 함유 된 세척 병을 사용하여 계란을 철저히 헹구고 E3 배지가있는 10cm 페트리 접시에 조심스럽게 옮깁니다. 미생물의 통제되지 않은 성장과 그에 따른 유충 발달의 결함을 피하기 위해 죽은 알이나 수정되지 않은 알을 포함하여 번식 상자에 쌓였을 수 있는 모든 파편의 판을 청소하십시오.
그런 다음 25 밀리리터의 E3를 함유 한 접시 당 70 또는 80 개의 계란의 밀도로 계란을 나눕니다. 첫날에는 투과 조명베이스가 장착 된 해부 스코프 아래에서 죽은 배아 또는 발달 결함이있는 배아를 확인하고 청소하십시오. 5 일째에 모든 접시의 유충을 15 센티미터의 페트리 접시에 넣고 메틸렌 블루없이 E3를 첨가하십시오. 유충을 먹이 상자에 나누고 텍스트 원고에 설명 된대로 먹이십시오.
유충을 제브라 피쉬 룸이나 인큐베이터에서 섭씨 28 도의 어두운 빛주기로 보관하고 5 일부터 12 일까지 하루에 두 번 먹이십시오. 매일 음식물 찌꺼기를 제거하고 1 밀리리터 피펫 팁에 부착 된 진공 시스템을 사용하여 배지의 90-95 %를 제거하십시오. 그런 다음 유충이 손상되지 않도록 메틸렌 블루가없는 새 E3를 먹이 상자의 한쪽 모서리에 조심스럽게 붓습니다.
또는 유충을 시스템 용수가있는 3 리터 탱크로 나누고 물 흐름이 적은 독립형 시스템 장치로 배치 할 수 있습니다. 이 대안은 일일 세척 과정에 필요한 시간을 절약하고 여과 시스템은 종말점까지 유충을 건강하게 유지하는 데 도움이 됩니다. 13 일째에 설정된 실험 조건의 수에 따라 수집 요리를 준비하십시오.
각 접시의 바닥을 덮을 수 있도록 메틸렌 블루없이 충분한 E3를 붓습니다. 그런 다음 조심스럽게 진공 시스템을 사용하여 공급 상자에서 물을 흡입하십시오. 수위가 낮아지기 시작하면 먹이 상자를 천천히 들어 올려 유충이 모서리 중 하나로 수영 한 다음 반대 방향으로 흡인합니다.
약 20-30 밀리리터의 액체 만 남으면 유충을 준비된 수집 페트리 접시에 조심스럽게 따라 내고 접시 뚜껑의 먹이 상자에서 라벨이 붙은 테이프를 놓습니다. 형광 실체 현미경에서 마취된 유충에서 원하는 형광 마커를 스크리닝합니다. 그런 다음 트리카인 E3를 상처 및 포착 장치의 챔버에 첨가하십시오.
P-200 마이크로 피펫을 사용하여 챔버와 억제 채널에서 기포를 제거하십시오. 여분의 트리카인 E3를 모두 제거하고 챔버를 채우기에 충분한 양만 남겨 둡니다. 다음으로, 마취 된 유충을 상처 및 포획 장치의 로딩 챔버로 옮기고 속눈썹 도구를 사용하여 왼쪽 엽의 이미징을 위해 배치합니다.
간에서 필요한 모든 세포의 형태를 텍스트 원고에 설명 된대로 컨 포칼 현미경으로 이미지화합니다. 피지 소프트웨어를 엽니다. 그런 다음 이미지 파일을 열고 채널 분할 옵션에서 바이오 포맷 가져오기 옵션 탭.
각 채널에 대한 최대 강도 투영을 만든 후 유충 간을 둘러싼 ROI를 만들고 간 영역을 측정합니다. 그런 다음 스케일 바를 참조로 추가하고 간 영역과 주변 영역의 75마이크로미터를 포함하는 두 번째 ROI를 만듭니다. 플러그인 메뉴에서 분석 옵션을 선택한 다음 Cell Counter를 선택하고 모집 영역 내의 면역 세포를 계산합니다.
모집 된 면역 세포의 수를 스프레드 시트에 기록하십시오. 간 영역당 면역 세포 수를 정규화하여 호중구, 대식세포 및 T 세포 밀도를 계산합니다. 정상적인 식단을 먹인 HCC 제브라피쉬 유충은 Oil Red O 염색으로 측정한 바와 같이 간 지방증을 나타내지 않습니다.
그러나 HCD를 먹인 HCC 유충은 간 지방증이 크게 증가합니다. 콜레스테롤 과잉에 노출 된 지 8 일 후, 간세포 암종 유충에서 간 확대가 관찰되었습니다. 간 비대를 평가하기 위해 간 면적, 간 표면적 및 간 부피를 평가했습니다.
비 알코올성 지방 간염 관련 간세포 암종에서 핵 영역과 함께 간세포 영역 및 핵 대 세포질 비율이 증가했다. 핵 순환성의 현저한 감소는 또한 고지방 식이 요법을 먹인 HCC 그룹에서도 관찰되었다. H2B-mCherry 마커를 사용하여 HCD를 먹인 HCC 유충에서 더 큰 소핵 발생률이 검출되었습니다.
간 혈관계 평가는 HCD를 먹인 HCC 유충에서 혈관 밀도의 상당한 증가를 보였다. 대 식세포와 호중구의 침윤은 HCD 유충을 먹인 HCC와 HCC 모두에서 발생했습니다. 간 및 그 주변의 대 식세포에서 호중구의 정량화는 HCD를 먹인 HCC 유충에서 세포의 수와 밀도가 현저하게 증가한 것으로 나타났다.
대조적으로, HCD를 먹인 HCC 유충에서 전체 수의 T 세포 밀도의 현저한 감소가 관찰되었다. 탱크의 청소와 먹이는 유충의 생존력을 보장하고 수질이 좋지 않거나 부적절한 먹이로 인해 지방증이나 간 및 전신 만성 염증의 발병을 피하는 가장 중요한 단계입니다. 타임 랩스 현미경 검사 및 간을 채우는 다른 세포 간의 상호 작용 분석과 같은 다른 방법을 수행 할 수 있습니다.
또한 다른 간암 단계에서 해부 된 간의 단일 세포 RNA 탐색을 수행하여 간 면역 환경이 질병 진행에 따라 어떻게 진화하는지 완전히 이해할 수 있습니다.
